[发明专利]抑制人hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物制药，涉及一种反义寡核苷酸， 特别是涉及一种抑制人hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸及其在制备肿瘤治疗药物中的应用。

背景技术

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，　是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡现象，在肿瘤发生、发展、肿瘤治疗、胚胎发育、免疫反应、神经系统发育、组织细胞代谢等过程中起重要作用。肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，主要是由于细胞内癌基因、抑癌基因及其他相关调节基因突变，从而使细胞基因组失去稳定性，最终导致肿瘤的发生。细胞凋亡是细胞监测系统重要的组成部分，如果其出现异常，会导致本应凋亡的细胞“非法”存活，造成细胞的失控性增殖，产生高度恶化状态的肿瘤细胞。在细胞癌变过程中，许多凋亡活化基因功能受阻，而凋亡抑制基因的功能得到增强。已经发现，不少肿瘤的发生机制就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、慢性白血病等。由于细胞凋亡异常在许多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。目前临床上采用的放射治疗，大多数化疗药物和生物治疗剂主要都是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。科学家们对未来肿瘤治疗的展望是通过凋亡疗法来增加杀死肿瘤的敏感性和特异性。即以诱导细胞凋亡为目标的基因治疗，通过分子生物学的途径在肿瘤细胞内导入诱导凋亡的活化基因或灭活凋亡的抑制基因，特异性的恢复并增强肿瘤细胞内的凋亡功能，提高肿瘤对放疗和化疗药物的特异性和敏感性，达到有效治疗肿瘤的目的。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ONDs）的概念最早提出于1967年,经过30多年的研究，人们已意识到在各种反义寡核苷酸的领域里，有可能寻找到更有效的抗病毒和抗肿瘤新药。其主要是根据碱基互补配时原则和核酸杂交原理,利用人工合成、天然存在的互补寡核苷酸片段,以反向互补方式特异性地与目的基因(单链、双链)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相结合,从基因复制、特录、剪接、转运翻译等水平上调节靶基因的表达,干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递,从而达到抑制、封闭或破坏靶基因表达,达到治疗疾病的目的。

磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）蛋白是一类能与磷脂酰乙醇胺（PE）结合的蛋白。该家族的所有成员都含有与PE结合的保守区域，PEBP家族来源广泛，包括果蝇触觉的气味结合蛋白（OBP）、盘尾丝吸虫感染后的免疫血清识别的抗原Ag16，酵母中抑制CDC25突变的TFS1因子，哺乳动物的Raf-kinase inhibitor，RKIP等等。PEBP存在于组织细胞液，不存在于血清，淋巴液和乳液。在大脑特别是少突状足细胞和男性生殖器官高表达，在膜的生物合成和维持膜隔离抗原中扮演着重要的角色。人和小鼠大脑中PEBP为十一氨基酸多肽海马趾类胆碱神经刺激肽（HCNP）前体蛋白，而HCNP促进乙酰胆碱的合成。PEBP家族成员功能广泛，涉及到抵抗凋亡，膜形成，精子的成熟等各方面的生理功能，并与肿瘤的发生、发展、转移具有一定的相关性。hPEBP4从正常人骨髓基质细胞中分离到一种新型PEBP，属于PEBP第四类亚家族，与PEBP家族蛋白具有高度同源性，在75位到195位为磷脂酰乙醇胺结合保守区域（PBP）其序列已在GenBank登录 (GenBank登录号AY037148)。hPEBP4高表达于乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌LINCaP细胞、卵巢癌CaoV-3细胞等多种培养细胞系，通过相关试验我们证明了hPEBP4在L929细胞中的过表达能抑制TNFα诱导的凋亡，而hPEBP4在上述肿瘤细胞中的表达沉默能促进TNFα诱导凋亡。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制人hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5 AAGGAGAGAGATGACTTTTCC 3’（SEQ ID No1），是采用合成的方式形成5’端aaga 和3’端的tttcc硫代修饰，是针对hPEBP4基因mRNA 393-411位的21个碱基，称之为OND-hPEBP4。

本发明的另一个目的是提供一种抑制hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸在制备抗乳腺癌药物中的应用，是特异性的靶向性针对抗凋亡基因hPEBP4及其表达蛋白，作用的靶位点 5’GGAAAAGTCATCTCTCTCCTT3’ （393-411）位。反义寡核苷酸序列SEQ ID No1为5’ AAGGAGAGAGATGACTTTTCC 3’ 。