[发明专利]利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法，特别是一种利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法，属于酶制剂制备与功能性低聚糖生产领域。

技术背景

随着公众饮食结构的变化，具有调节生理活性功能的食品——功能性食品需求量增大，其中功能性低聚糖尤其受到人们的青睐。我国于2007年启动了“国家公众营养改善OLIGO（低聚糖）项目”，使功能性低聚糖的市场需求大幅增加。其中，低聚半乳糖因具有水溶性好、粘度低，对热和酸稳定等优点，可用于提高食品色泽、风味、质地以及延长货架期；同时，低聚半乳糖还可增殖肠道内的双歧杆菌，改善人体肠道菌群分布与脂质代谢，并可促进钙、维生素吸收，提高人体免疫力，因此开发低成本制备低聚半乳糖的技术方法具有重要意义。

目前，低聚半乳糖多以乳糖为底物，利用β-半乳糖苷酶的催化活性将乳糖水解生成的半乳糖基转移至乳糖上而制得，其中β-半乳糖苷酶的提取纯化是制约低聚半乳糖工业化生产的关键。β-半乳糖苷酶广泛存在于动、植物和微生物中，已报道的产酶微生物包括细菌、霉菌和酵母菌等，其中酵母菌产酶的最适pH为中性，适于牛乳水解及治疗乳糖不耐症；但由于乳酸克鲁维酵母产生的β-半乳糖苷酶为胞内酶，使得提取纯化过程复杂、且难度大、效率低，因此利用游离β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺成本较高。

细胞膜具有选择透过性，采用透性化技术处理细胞，可改变其通透性，同时保持细胞整体结构完整，并可保证胞内酶仍具有催化活性。渗透处理方法包括物理法（如渗透压法、反复冻融法、热休克法和超声细胞破碎法）、化学法（如表面活性剂法、有机溶剂法和螯合剂法）以及生物化学法（如抗生素法和酶法）等。专利CN 1225389A利用无水乙醇和氯仿，经过冷冻干燥处理得到透性化乳酸克鲁维酵母细胞β-半乳糖苷酶，但制备过程中因使用氯仿，使产品不能直接用于食品行业。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用透性化细胞β-半乳糖苷酶，操作简便且低成本的制备低聚半乳糖的方法。

本发明的另一目的是提供一种无毒性的透性化细胞β-半乳糖苷酶的制备方法，该透性化细胞β-半乳糖苷酶是由乳酸克鲁维酵母经细胞渗透处理技术而获得，能够以乳糖为底物催化合成低聚半乳糖。

为了实现上述目的，本发明所选产β-半乳糖苷酶的菌株为乳酸克鲁维酵母，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（北京），菌种名称：乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），CICC编号：1773。

本发明的技术方案如下：

一种利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化细胞β-半乳糖苷酶，乳糖溶液浓度为100~500g/L，透性化细胞β-半乳糖苷酶加入量为200~1500mg/g乳糖，30~45℃，反应2~15h后，离心分离，得到的上清液即为低聚半乳糖溶液。

本发明所述透性化细胞β-半乳糖苷酶的制备方法为：由乳酸克鲁维酵母经细胞渗透处理技术获得，所用乳酸克鲁维酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种名称：乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），CICC编号：1773。

上述细胞渗透处理技术为：向每克乳酸克鲁维酵母细胞中加入50~200mL的PBS缓冲液（50mmol/LpH 8.0NaH₂PO₄-Na₂HPO₄）制得悬浮细胞；再向其中加入无水乙醇，无水乙醇与悬浮细胞的体积比为2:5~1:1，于25℃下振荡1~15min，离心后弃去上清液，所得沉淀经PBS缓冲液洗涤两次后即得透性化细胞β-半乳糖苷酶。

上述乳酸克鲁维酵母的发酵条件为：温度28~30℃，摇床转速100~250rpm，接种量5~10%（v/v），在液体培养基中培养8h~30h。

上述乳酸克鲁维酵母发酵所用液体培养基组成与配制方法为：酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。

本发明利用透性化乳酸克鲁维酵母细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，其有益效果在于：

（1）利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，避免了胞内酶的提取纯化过程，简化了工艺操作，降低了生产成本。

（2）透性化细胞中β-半乳糖苷酶所处环境仍为胞内环境，使其表现出比游离酶更高的催化合成低聚半乳糖的活性，更有利于发挥其催化功能。