[发明专利]泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种在临床样本中快速检测泰国型α-地中海贫血基因型的试剂盒。

背景技术

α-地中海贫血“thalassemia”（简称α-地贫）是一种常染色体隐性遗传病，是世界上最常见的人类单基因遗传病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病。该疾病是由于珠蛋白基因序列的缺失或突变，导致α-珠蛋白肽链合成障碍，使ɑ-珠蛋白肽链合成减少或不能合成引起的，使组成珠蛋白的α链和β链合成失去平衡而导致的溶血性贫血病。

人类α珠蛋白基因簇位于16号染色体p13.3，长约40kb，每条染色体各有2个α珠蛋基因，一对染色体共有4个α珠蛋白基因；大多数α地贫是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。就一个单倍体个体而言，根据α珠蛋白合成减少的程度，可将α地贫分为两类缺陷：一类为α地贫1（α⁰-地贫），特点是缺失2个α基因，α珠蛋白合成完全受阻，我国较常见的为东南亚缺失型地贫（--^SEA）；二类为α地贫2（α⁺-地中海贫血），由一个α基因发生突变或缺失引起的。我国大约80%的α地中海贫血是由编码α蛋白的基因（α2或/和α1）缺失所致；最常见的缺失类型为-α^3.7、-α^4.2、--^SEA 3种。随着α-地贫机制的进一步阐明，一些新的基因缺失类型相继被发现，例如--^11.1、-α^2.4、-α^2.7、菲律宾型α地贫（--^FIL）、泰国型α地贫（--^Thai）和（香港型α地贫）HKαα等。

自从Boonsa等报道了（--^Thai）以来，陆续有病例被检出。泰国型α-地贫基因缺失片段比东南亚基因缺失地贫（--^SEA）片段还要长，在临床上可以形成中重型α地中海贫血，即泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎。由于泰国型的血液学特征与东南亚缺失型α地贫一致，均表现出小细胞低色素，MCV降低和MCH降低等，因而可能造成误诊和漏诊，继而造成泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎儿的出生。因此，开展泰国型α-地贫（--^Thai）检测对遗传咨询及产前诊断具有重要意义。

现有α-地贫检测技术主要有血常规检测、红细胞脆性检测、血红蛋白电泳等，这些方法的缺陷是只能对患者进行初步的地贫筛查，无法对患者基因型进行确诊，而且对轻型地贫容易漏诊，造成下一代重症地贫患儿的出生。近年来出现了根据α-地贫基因确诊的方法，检测方法有Southern杂交、多重Gap-PCR、多重连接酶依赖探针扩增技术（MLPA)、实时荧光定量PCR、反向点杂交、直接测序技术等方法，各基因诊断方法简述如下：

（1）Southern杂交技术：Southern印记杂交技术和放射性同位素标记的α、β珠蛋白基因探针进行杂交，根据图谱，可鉴别诊断α-地贫1、α-地贫2、HbH病、Bart′s水肿胎等。该方法虽然准确性较高但操作繁琐、费时费力、DNA需求的量大、需要放射性标记，且不能应用于非缺失基因的检测，因而一般只适合研究使用，不适于临床的推广应用。

（2）依赖探针连接扩增技术（MLPA)：MLPA是2002年发展起来的常用于α地贫缺失基因的检测，但由于检测成本高，操作繁琐，耗时较长，检测流程长达16小时，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使用，不便于分子筛查方法的推广应用。

（3）测序技术：测序技术直接对DNA序列的分析，一直被认为是临床检测的金标准；目前测序技术面临着标本的处理（核酸提取）、扩增标准化认证问题，信号检测、测序平台特异的出错和纠错问题，以及生物信息学方面可能出现的问题，临床验证程序和标准化问题等，一直没有有效的解决，因此还未能在临床中推广应用。

（4）反向点杂交（Reverse Dot Blot，RDB）：本法是在PCR扩增的基础上，将已标记在引物上的PCR产物与固定在膜条上的特异性探针杂交，再通过激发荧光或一系列显色反应观察结果。这种方法灵敏，但耗时较长，一般用于点突变检测。