[发明专利]少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a及其基因和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

钾通道是细胞膜上的一种重要的跨膜蛋白，具有非常重要的生理意义。钾通道广泛的分布于骨骼肌、神经、心脏、血管、腺体等细胞。是目前发现种类最多，作用最为复杂的一种离子通道。钾离子种类繁多分布也十分广泛，其中钾离子通道亚型Kv1.3 主要分布于T细胞的表面，是效应T细胞持续活化的关键。

T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子，抵御身体中疾病感染以及肿瘤形成。银屑病俗称“牛皮癣”是一种与T细胞密切相关的自身免疫性疾病，改善自身免疫力是治疗银屑病的一种重要方法。Kv1.3作为T细胞持续性活化的一个重要因素，在T细胞的生理功能上扮演重要作用，目前已经证实Kv1.3与许多疾病密切相关，Kv1.3也已经成为药物开发的热门靶点。Kv1.3介导的自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、银屑病、肝炎、多发性硬化、肥胖症、移植排斥和炎症性神经病密切相关。Kv1.3的抑制剂中类黄酮可以用来治疗红斑狼疮、相关风湿疾病；Shk毒素类似物用于预防肥胖和II型糖尿病。

蜈蚣是一种传统中药，性温，味辛，有毒。具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛之功能。蜈蚣毒腺中含有丰富的多肽成分，目前已经证实了这些多肽成分多为神经毒素。多肽能够选择性的抑制钠通道，钾通道或是钙离子通道，因此蜈蚣毒液中的成分具有广泛的应用前途，如开发成为镇痛药物、及治疗自身免疫疾病药物。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a及其基因和应用。

本发明提供的少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a，是从少棘蜈蚣粗毒中通过分子筛和反向高效液相色谱分离纯化得到，其氨基酸序列（SEQ ID NO:1）为TDDESSNKCAKTKRRENVCRVCGNRSGNDEYYSECCESDYRYERCLDLLR N，该多肽包括51个氨基酸残基分子量为6042.57Da，等电点为5.3，分子内含有三对二硫键其配对方式为1-5,2-4,3-6。

少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a的基因克隆包括：

少棘蜈蚣毒腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选少棘蜈蚣钙离子通道激活剂多肽基因。扩增引物长度为17个核苷酸，其序列为5’-GCGAAAAATGGAAATCT-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3＇。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。

基因测序结果表明编码少棘蜈蚣钙离子通道激活剂的基因（SEQ ID NO:2）由563个核苷酸组成，自5’端至3’端序列基因序列包括了信号肽、前体肽和成熟肽，其中下划线部分为成熟肽。

本发明的少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a在制备与T细胞相关的免疫疾病药物中的应用。

本发明的少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a，对大鼠背根神经节上的钾离子通道有明显的抑制作用，该毒素能够选择性的作用于钾通道亚型Kv1.3，小鼠的银屑病和乙肝模型表明该多肽具有很好的治疗效果，能够在治疗银屑病和乙肝药物中的应用。

附图说明：

图1-A至图1-D为多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a的分离纯化。其中：图1-A毒素经过G50分子筛的分离图，其中箭头所示为目的峰。图1-B目的毒素第一次反向HPLC图谱，其中箭头为目的多肽。图1-C目的分子第二次反向HPLC。图1-D目的分子的质谱鉴定图。