[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗。 

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)同属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，两种病毒感染后所引起的临床症状极其相似，给养猪业带来严重危害。 

PEDV经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞变性、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引起渗透性腹泻。造成掉膘、降低饲料利用率，浪费药物和人力等所造成的经济损失是非常严重的。该病是世界性的疾病之一，亚洲、欧洲以及美洲等国家的许多猪阳性率都有很高。

M蛋白是由226个氨基酸组成、分子质量为27KD～32KD的膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用。M蛋白在感染细胞中位于高尔基体内，不能被转运到细胞膜，由3个结构域组成，即暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端区、病毒囊膜中大的C末端区和中间为α螺旋区。在补体存在的条件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性。另外，M蛋白能介导机体产生α干扰素，所以M蛋白可以作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。

乳酸乳球菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，因其在食品工业各个领域中的长期应用已证明不具有致病性，被公认为安全级微生物。利用一些乳酸乳球菌在胃肠道、泌尿、生殖系统中或黏膜部位粘附存活且无病原性等特点，广泛开展了活菌口服后在体内定植及疫苗的研究。

然而，现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题，而通过口服免疫时，免疫原在到达小肠粘膜之前会存在被降解或灭活的可能，虽然以细菌病毒为活载体可达到这一目的，但细菌病毒对人体会有一定的伤害性，且不能在肠道粘膜定居。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种安全无毒，能在肠道粘膜定居的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗。 

本发明采用如下技术方案：

它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-M  CCTCC M 2012354；保藏名称：一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗：乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-M　lactococcus lactis MG1363/pMG36e-M；保藏日期2012.9.16；保藏单位地址：中国武汉武汉大学。

本发明猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法的有益效果是：可以口服，口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。以细菌病毒为活载体均可达到这一目的，但作为安全无毒，能在肠道粘膜定居的活载体系统，乳酸乳球菌是最合适的载体系统。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。

附图说明

图1为酶切鉴定结果图； 

图2为Western blot分析结果图；

图3为冻干曲线图。

具体实施方式

请参阅图1、图2和图3所示，本发明的一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤： 

1).合成M基因

将合成M基因连接到PES载体上，按照合成序列说明书进行酶切，分别克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态JM109细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定的阳性质粒（见图1）；

2).表达载体的构建