[发明专利]一种基于位点特异性重组的抗生素生物合成基因簇的克隆方法

权利要求书

1. 质粒pZB201，其序列如SEQ ID No. 1所示。

2. 一种抗生素合成基因簇的克隆方法，其特征在于具体步骤为：首先构建靶标基因簇上下游的两个同源重组载体，将φBT1整合酶所识别的位点attB和attP分别插在靶标基因簇的两侧；再通过φBT1整合酶介导的位点特异性重组反应，使基因簇自身环化，从而完成基因簇的克隆。

3. 根据权利要求2所述的抗生素合成基因簇的克隆方法，其特征在于，抗生素合成基因簇为erythromycin，具体步骤如下：

（1）erythromycin基因簇上游同源重组载体pEry-up的构建

以红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea的基因组为模板，用引物SEQ ID No. 2和引物SEQ ID No. 3扩增大小为1993bp的erythromycin基因簇上游同源臂片段,与pMD19-T载体做T-A克隆，得到质粒T-ery-up，选取MunI位点和T载体上的XbaI位点邻近的方向，质粒pTARBAC2.1和质粒pDZY101分别用NheI、EcoRI和XbaI、EcoRI进行双酶切，产生大小为7478bp和4178bp的两条片段，连接目的片段，得到质粒pBAC-DZY101；质粒pBAC-DZY101再用NheI和EcoRI进行消化，产生大小为9500bp的目的片段；质粒T-ery-up用MunI和XbaI进行消化，产生大小为4683的目的片段，连接两条目的片段，得到质粒pEry-up，序列如SEQ ID No. 4所示；

（2）载体pEry-up的同源插入

将构建好的载体pEry-up转化至大肠杆菌ET12567, 挑取阳性转化子与红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea进行接合转移，30℃培养16~20h后，在平板表面覆盖lml含萘啶酮酸和卡那霉素的无菌水，30℃培养5天以上挑取接合子；

（3）erythromycin基因簇下游同源重组载体pEry-down的构建

以质粒pSET152为模板，用引物SEQ ID No. 5和引物SEQ No. 6扩增大小为2283bp的片段,与pMD19-T载体做T-A克隆得到质粒pT-SET152；以质粒pCY104 为模板，用引物SEQ ID No. 7和引物SEQ ID No. 8扩增大小为847bp的片段，与pMD19-T载体做T-A克隆，得到质粒pT-CY104，挑选PCR产物片段上NheI位点离T载体上HindIII位点较远的方向；再用限制性内切酶HindIII、XbaI和HindIII、NheI分别对质粒pT-SET152和质粒pT-CY104进行双酶切，产生大小为2315bp和870bp的两条目的片段，连接后得到质粒pCY104-SET152；以红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea的基因组为模板，用引物SEQ ID No. 9和引物SEQ ID No. 10扩增大小为2194bp的 erythromycin基因簇下游同源臂片段,与pMD19-T载体做T-A克隆，得到质粒pT-ery-down；质粒pT-ery-down和pCY104-SET152再进一步用限制性内切酶XbaI、MunI和XbaI、EcoRI分别进行双酶切，产生大小为2200bp和3129bp的两条目的片段，连接后得到质粒pEry-down，序列如SEQ ID No. 11所示；

（4）载体pEry-down的同源插入

将构建好的载体pEry-down转化至大肠杆菌ET12567, 挑取阳性转化子与插入了上游同源载体pEry-up的红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea进行接合转移，30℃培养16~20h后，在平板表面覆盖lml含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的无菌水，30℃培养5天以上挑取接合子；

（5）红色糖多孢菌染色体基因组的抽提及体外φBT1整合酶所介导的erythromycin合成基因簇的克隆

抽提插入了同源载体pEry-up和pEry-down的红色糖多孢菌基因组，确保基因组片段包含全部的erythromycin基因簇序列；将基因组片段与φBT1整合酶在特定的buffer中30°C温育过夜；在φBT1 整合酶的作用下，erythromycin基因簇两侧的attB和attP位点发生位点特异性重组反应，进而得到包含erythromycin合成基因簇的全序列，记为质粒pZB201，其序列如SEQ ID No. 1所示。