[发明专利]鸡IBD病毒VP2和鸡IL-2的融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程亚单位疫苗技术领域，具体涉及IBD病毒VP2蛋白和鸡IL-2的融合蛋白及其应用，即鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和鸡IL-2的融合蛋白及应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊，从而导致免疫抑制，增加了机体对其它病原体的易感性，降低对其它疫苗的反应性，国外学者形象地称该病为鸡的“艾滋病”。虽然各国学者在 IBD 疫苗的研究上取得了巨大成就，但均未能从根本上扭转 IBD 流行日趋严重的现状。近十几年来，由于鸡传染性法氏囊病病毒IBDV超强毒株和变异株的出现、抗原变异和血清亚型的多样性，使目前的商品化疫苗不能提供足够的保护，其保护率仅达10%~70%。超强毒株的毒力是标准病毒株的两倍以上，使鸡的发病率和死亡率明显上升，年龄较大的鸡甚至18周龄以上的后备母鸡也能致病。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗已经面临着严峻的考验。因此，需要筛选出新的超强毒株的变异基因来制备新的疫苗。

鸡白介素-2（Interleukin-2，IL-2）是重要的免疫调控因子，能以非特异性的方式增强针对特异性抗原的免疫力。众多试验结果与临床应用表明IL-2作为疫苗佐剂在治疗多种感染性疾病时具有良好的佐剂效应。IL-2的免疫增强剂不同于以往的化学佐剂，它们能调节动物对疫苗的反应，包括免疫细胞向接种部位移动，抗原提呈，促进Th细胞的产生，B细胞的成熟和分化，激活包括NK细胞、嗜酸性细胞和肥大细胞在内的非特异性杀伤细胞。而将IBD的VP2蛋白与IL-2蛋白融合表达，能增强IBD的VP2免疫力，刺激细胞免疫，从而提高IBD VP2亚单位疫苗的使用效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种IBD病毒VP2蛋白和IL-2的融合蛋白及其应用，涉及一种IBDV VP2蛋白与鸡IL-2融合蛋白的制备及应用，即将临床分离的IBDV超强毒株的VP2蛋白与免疫增强作用的IL-2蛋白通过一个柔性linker连接起来，获得了一个融合蛋白，该蛋白经过纯化后制成疫苗可以是免疫鸡抵抗IBDV强毒及超强毒的攻击而不引起免疫抑制。

本发明的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

用于编码上述融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的融合蛋白用于制备亚单位疫苗。

上述的亚单位疫苗的制备方法如下：取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加6份的司本-80高压灭菌作为油相备用；取灭菌的4份吐温-80，加入96份的融合蛋白，充分搅拌至吐温-80完全溶解作为水相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即可制备鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗。

上述制备的亚单位疫苗用来防治鸡传染性法氏囊病。

本发明是将鸡IBDV超强毒的VP2蛋白与具有免疫增强作用的鸡IL-2蛋白融合表达，制备的疫苗经皮下注射后对鸡抵抗鸡传染性法氏囊病强毒攻击具有坚强的抵抗力。

具体实施方式

IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是最主要宿主保护性抗原，而鸡IL-2具有明显的免疫增强作用，本发明是用重叠延伸PCR方法将两种基因通过linker连接起来，克隆到pET-28a载体上，转化BL21(DE3)，经IPTG诱导后VP2-IL2融合蛋白获得了表达，将表达菌体高压匀浆破碎后离心取上清即为VP2-IL2蛋白溶液，加入矿物油佐剂制成油乳剂疫苗，可用于预防鸡传染性法氏囊病，效果优于VP2亚单位疫苗。

下面结合具体的实施例对本发明的融合蛋白进行详细的描述。

一、VP2基因的筛选

用Primer5.0软件设计了一对扩增鸡传染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5′端加入保护性碱基及BamH I酶切位点，在下游引物的5′端加入保护性碱基和Xho I酶切位点，引物序列为：

Primer 1：5′-GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3′

Primer 2：5′-CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3′