[发明专利]一种人羊膜上皮细胞体外免疫调控淋巴细胞分子机制的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及免疫学领域，特别涉及一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法。

背景技术

协同共刺激分子在T淋巴细胞的活化增殖中起到很重要的作用。“协同刺激信号”是1970年由Bretseher和Cohn在T细胞活性双信号模型的基础上提出的，即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第一个信号外，还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用，达到生理活化阈值后才能使T细胞产生正常的免疫调节机制。如果缺乏协同共刺激分子的第二信号，将会导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受。B7家族是唯一能从APC单向传送信号至T细胞的协同共刺激分子，PD-L1是B7家族一个重要的负性协同刺激分子，抑制T细胞的活化增殖，在机体免疫应答中发挥了重要的调节作用。

以往的实验已经验证了AECS低表达HLA-DR，并对活化的T细胞具有抑制作用，但AECS是否表达与T细胞活化或抑制相关的协同刺激分子以及其中的机理，未见相关的文献报道。以负性协同刺激分子PD-L1为切入点，通过流式细胞仪检测、免疫荧光染色、³H-TdR掺入法、ELISA等实验分析PD-L1在AECS介导的T细胞体外增殖抑制作用中所扮演的角色，从而验证PD1-PD-L1分子通路是AECS体外调节T细胞免疫耐受的主要信号机制。

发明内容

本发明提出一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，首先在体外分离及培养人AECS,应用免疫荧光染色方法检测AECS表面负性协同刺激分子PD-L1的表达，通过PD-LlmAb阻断实验，AECS与T细胞体外共培养观察T细胞增殖及细胞周期、细胞因子分泌情况等证实其对T淋巴细胞的抑制作用及内在的分子机制，整个验证过程将包括如下步骤:

S1：羊膜上皮细胞分离培养与鉴定；选用剖宫产后的人羊膜，大小约15*15cm,分离、去除残留的绒毛膜，PBS（Gibco BRL公司），洗尽血迹后用0.125%胰酶，37°C消化10min,重复4次，1000rpm,离心6min收集，用PBS洗3次后接种在含10%FBS+RPMI1640培养皿中，于37°C含5%CO2空气的培养箱内培养。每3-4d进行换液，待细胞生长铺满至瓶底80％-90％时传代，培养第二代的细胞用于实验。用于实验之前的细胞进行流式细胞仪检测细胞表型，先将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS液调整细胞浓度为1x10⁶／ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29．FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CDl05-FITC、CDl06-PE、CDl66-FITC、HLA-DR-PE、置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。

S2：免疫荧光染色法检测AECS中PD-L1表达；将以多聚赖氨酸处理的盖玻片置于六孔培养板中，取2代细胞种于此六孔板中。1～2d后吸取培养基，加入4％的多聚甲醛固定细胞，用PBS冲洗后，加入抗人PD-LlmAb后置于湿盒中4°C过夜，冲洗后再加入PE荧光二抗，置室温1h，最后加入Hoechst33258五分钟。用50％甘油封片，用荧光显微镜观察。

S3：PD-L1mAb阻断AECS对T细胞增殖的抑制作用检测；将2代的AECS用丝裂霉素(10ng／m1)处理，PBS洗三遍，接种于96孔板中lxl0⁴／孔，每孔加入T细胞lxl0⁵／孔，同时加入PHA(50μg／m1)，实验分为5组：T、T+PHA、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+antiPDLl、T+PHA+AECS+mlgG组；将细胞于37°C、5％CO2条件下培养72h。在结束前18h加入³H-TdR(1μCi／孔)，收集细胞，用β液体闪烁计数仪检测cpm值，根据cpm值的大小，进行分析比较。

S4：AECS与T细胞体外共培养及PD-L1阻断实验；取二代AECS，用10ug／ml的丝裂霉素处理1h，胰酶消化，洗涤5遍，用含有10％FBS的LG-DMEM完全培养基调整浓度为1．0×10⁵／孔，接种于24孔培养板中。接种T细胞7x10⁶／ml，加入PHA(30μg／m1)或和PD-LlmAb(10μg／m1)同时加入。实验分组为T、T+AECS、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+PD-L1、T+PHA+AECS+mlgG、AECS。24h后观察细胞形态。