[发明专利]脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法，其特征在于应用全反式维甲酸和细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，所述诱导方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离、原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测；其中，

所述的UC-MSCs的分离、原代培养的步骤包括：无菌条件下，将健康胎儿的脐带用含有双抗和两性霉素的D-Hanks液充分冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，将组织块移至内含一磁力搅拌子的玻璃瓶中，加入胶原酶37℃下持续磁力搅拌消化30分钟；向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的FBS终止消化；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟旋转15分钟洗涤后收集细胞；用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×10⁶细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，得到原代细胞；

所述的UC-MSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆盖瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例在细胞培养箱中传代培养，计为第1代UC-MSC；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增；

所述的UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞步骤包括：取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成全反式维甲酸联合细胞因子的诱导培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养；待培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养；无菌条件下，在倒置显微镜下用玻璃微针将其中的大于200μm的大克隆球切成数块，继续培养；7～10天传代1次；传代后的细胞再无血清诱导培养基培养体系中继续培养；

所述的神经干细胞的分化培养步骤包括：将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养；以及

所述的免疫荧光法检测步骤包括：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12小时后行荧光检测；经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21天行荧光检测。

2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法，其特征在于，所述的UC-MSCs的传代培养与扩增步骤中，所述的传代培养体系为20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液。

3.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法，其特征在于，所述的UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞步骤中，所述的诱导培养基为DMEM+10％FBS+1μmol/L ATRA+20ng/mlbFGF+20ng/ml EGF。