[发明专利]广谱促生生防芽孢杆菌B96-II发酵液的制备方法

说明书

技术领域

本发明是涉及一种生防菌发酵液的制作方法，具体为一种具有防治蔬菜瓜类以枯萎病为主的土传病害及对多种蔬菜有促生效果的广谱促生生防芽孢杆菌B96-II发酵液的制备方法。

背景技术

蔬菜瓜果是人们日常生活不可或缺的食品，凡有人有土地的地方几乎都有蔬菜瓜果的种植，然而瓜菜枯萎病、立枯病、疫病等土传病害始终与菜果相随。近年来，随着设施农业的不断进步，为方便产销运输，规模化大面积单一种植的生产方式与日俱增，为病原菌的繁殖和扩散提供了适宜的寄主和环境，导致土传病害日趋严重。用化学药剂进行土壤处理是防治土传病害的重要方法，如溴甲烷是世界上公认的高效土壤熏蒸剂，在发达国家曾广泛用于园艺作物土传病害的防治，但该化合物显著消耗大气臭氧层，严重影响地球生态环境和人类健康。除熏蒸剂外，用于土壤处理的化学药剂还有五氯硝基苯、敌克松等，但由于效果不佳、成本太高、毒副作用太大等问题而难以广泛推广，有些甚至已被禁用。目前，经过防治实践证明，利用有益微生物来拮抗土传病原菌是长期而有效的方法，土传病原菌由于发生环境相对稳定，适合微生物的定植和存活，宜于开展生物防治；但是现有生物农药的防治对象多为单一目标，针对性较强、广谱性较差。

发明内容

本发明为了解决现有微生物的防治对象针对性较强、广谱性较差的问题，提供了一种广谱促生生防芽孢杆菌B96-II发酵液的制备方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：广谱促生生防芽孢杆菌B96-II发酵液的制备方法，包括如下步骤：

（一）菌种活化：将2-3代芽孢杆菌B96-II菌种接入预先制作3-5天、温度保持在4-10℃的PDA斜面培养基，在28℃恒温培养箱内培养2-3天，得到PDA斜面菌种；

（二）制作B96-II种子液培养基：取洗净削皮的马铃薯200g,切1cm方块，1L清水煮沸再温火煮30分钟，过滤后将滤液用蒸馏水定容至1000mL，加入磷酸二氢钾1-10 g、氯化钠1-10g、葡萄糖10-20g混合均匀后121℃灭菌20-30分，得到B96-II种子液培养基；

（三）制作B96-II种子液：待B96-II种子液培养基自然冷却后，将步骤（一）制得的PDA斜面菌种接入，30-34℃摇床，150-180转/分，培养24-36小时，得到B96-II种子液；

（四）制作B96-II发酵液体培养基：玉米粉1-10g、黄豆粉1-10g、蛋白胨1-10g、磷酸二氢钾1-10g、氯化钠1-15g、硫酸铵1-15g、碳酸钙1-10g、硫酸镁0.1-10 g、硫酸锌0.1-10g 、氯化锰0.1-10g 、酵母膏1-10g、葡萄糖10-200g、水1000mL，121℃灭菌20-40分，得到B96-II发酵液体培养基；

（五）制作B96-II发酵液：将步骤（三）制得的B96-II种子液按10-20%体积浓度接入步骤（四）制得的B96-II发酵液体培养基中（如1000mLB96-II发酵液体培养基需要100-200mLB96-II种子液），30-34℃摇床， 150-180转/分，培养48小时，得到的菌液即为B96-II发酵液。

本发明所述的芽孢杆菌B96-II菌株已在非专利文献——2009年15卷06期《应用与环境生物学报》上以论文“拮抗菌B96-II对芦笋枯萎病的抑菌作用”的形式公开，公众欲获得该菌株可向山西省农业科学院山西省农药重点实验室申请获取，该菌株的合法持有者——山西省农业科学院山西省农药重点实验室，该室保证在符合法律等有关规定的条件下，将从申请日起二十年内向公众提供该菌株。

山西省农药重点实验室从1996年开始，针对蔬菜枯萎病、疫病等土传病害筛选高效拮抗菌。经对上万个平皿、50余次温室和田间防病筛选试验证明：芽孢杆菌B96-II拮抗菌对芦笋茎枯菌、芦笋枯萎病、辣椒枯萎病、辣椒疫病、番茄枯萎病、番茄早疫病、黄瓜枯萎病、黄瓜猝倒病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、苹果霉心病等17种蔬菜瓜类病原菌有明显的抑制作用，对芦笋、青椒、辣椒、番茄、芹菜、黄瓜、西瓜、甜瓜等多种蔬菜有促生作用。