[发明专利]艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法及检测用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及艰难梭菌肠毒素A、B的检测方法及检测用试剂盒。

背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile）是具有芽胞结构的革兰氏阳性厌氧杆菌，是公认的院内感染和抗生素相关性腹泻最重要的病原体，通过释放细胞毒素可引起伪膜性肠炎，甚至可致死。艰难梭菌可释放多种毒素，其中以A、B两种毒素为主，这两种毒素是导致腹泻与肠炎症的主要原因。

艰难梭菌实验诊断方法主要依靠传统的厌氧培养、细胞毒性试验、菌体及毒素抗原检测。其中，细菌厌氧培养和细胞毒素中和实验是目前实验室检测艰难梭菌的“金标准”。细菌培养是传统检测方法中最灵敏的方法，但是必须进行二次检测以判断产物毒素是否存在，并且需要进行细胞毒素试验以验证是否为产毒艰难梭菌。该试验的特异性和灵敏性较好，但是条件设备要求高，还需要专业的细胞培养技术和连续的组织培养，仅培养时间至少需要24h以上，影响临床做出及时诊断和治疗。因此传统方法在日常监控、暴发事件病原体确定和溯源追踪等方面存在着瓶颈。

随着免疫学和分子生物学的发展，近二十年来一系列的快速检测方法被应用到微生物的检测和鉴定中。这些快速检测方法能够在48小时内得到结果。现阶段研究较为深入的快速检测方法包括酶联免疫吸附（ELISA）。谷氨酸脱氢酶（GDH）为艰难梭菌表面大量表达的抗原性酶蛋白，但免疫酶学试验无法区分艰难梭菌产毒株与非产毒菌株。另外，目前商品化免疫学的艰难梭菌毒素诊断产品只能检测A毒素，这导致临床A-B+艰难梭菌引发的许多患者漏诊，使A-B+型艰难梭菌引起的严重感染和爆发报道增多。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法，它可以快速、简便地检测艰难梭菌，且检测的灵敏性和特异性高。

为解决上述技术问题，本发明的艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法，步骤包括：

1）提取待测样品DNA；

2）以待测样品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应；

3）对PCR反应中每个循环产物的荧光进行检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度，判断待测样品中是否含有艰难梭菌肠毒素A、B。

本发明要解决的技术问题之二是提供用于上述方法的特异性扩增艰难梭菌肠毒素A基因的引物对。该引物对的上游引物具有如SEQ ID No:1所示的序列或其互补序列，下游引物具有如SEQ ID No:2所示的序列或其互补序列。

本发明要解决的技术问题之三是提供用于上述方法的特异性扩增艰难梭菌肠毒素B基因的引物对。该引物对的上游引物具有如SEQ ID No:4所示的序列或其互补序列，下游引物具有如SEQ ID No:5所示的序列或其互补序列。

本发明要解决的技术问题之四是提供用于上述方法的特异性检测艰难梭菌肠毒素A的荧光探针。该探针具有如SEQ ID NO:3所示的序列，序列的两端分别带荧光基团和淬灭基团。

本发明要解决的技术问题之五是提供用于上述方法的特异性检测艰难梭菌肠毒素B的荧光探针。该探针具有如SEQ ID NO:6所示的序列，序列的两端分别带荧光基团和淬灭基团。

本发明要解决的技术问题之六是提供用于上述检测方法的试剂盒。该试剂盒包括有上述特异扩增艰难梭菌肠毒素A、B基因的引物对和特异检测艰难梭菌肠毒素A、B的荧光探针。

与现有检测方法相比，本发明的双重荧光定量PCR检测方法，不仅能检测艰难梭菌肠毒素A，而且能同时检测艰难梭菌肠毒素B，从而有助于临床对由A-B+艰难梭菌引发的患者的及时诊断，减少A-B+型艰难梭菌引起的严重感染。另外，本发明的检测方法不仅操作简便、快速，而且检测的灵敏性和特异性高，可应用于艰难梭菌引起突发疫情的实验室应急检测。

附图说明

图1是艰难梭菌肠毒素A的荧光qPCR扩增曲线图。曲线1至5依次为100000、10000、1000、100、10拷贝数。

图2是艰难梭菌肠毒素A的荧光qPCR定量标准曲线。

图3是艰难梭菌肠毒素B的荧光qPCR扩增曲线图。曲线1至5依次为100000、10000、1000、100、10拷贝数。

图4是艰难梭菌肠毒素B的荧光qPCR定量标准曲线。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图，详述如下：

实施例1

1．实验材料

1.1细菌株与待测样品