[发明专利]固定化漆酶对多环芳烃污染土壤的修复方法

说明书

技术领域

 本发明涉及固定化漆酶对多环芳烃（PAHs）污染土壤的修复方法，具体的说是采用两种方法对漆酶进行固定化，在不同的温度，不同的pH下，用于多环芳烃污染土壤的修复，目的是对通过固定化漆酶对多环芳烃的降解，为有机污染土壤的修复开辟一条新的途径。

背景技术

漆酶(laccase，E.C.I.10.3.2) 是一种发现较早的含铜的多酚氧化酶，早在1883 年，日本人吉田从漆树的分泌物中发现了一种蛋白质，它可使油漆迅速固化。漆酶能够催化许多酚类化合物发生氧化反应，并使用分子氧作为电子受体将其还原成水。漆酶作用的底物相当广泛，包括多酚、甲基替代单酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯，以及其它容易氧化的化合物^[。由于具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化生物传感器构建等方面具有重要应用价值。

与直接利用微生物处理污染物相比：酶催化反应具有以下优点：①分解效率高。②毒性小，易操作。微生物常常具有致病性，而酶对环境很友好。因为酶及其反应产物在环境中极易进一步被生物降解。③使用范围宽。酶可以在较宽的pH、温度及盐浓度范围内处理低浓度或较高浓度的污染物，而微生物一般仅适用于处理较低浓度的污染物。酶的主要缺点是价格高，且易受各种因素（如盐的浓度、pH 及有机溶剂等) 的干扰变性失活。但随着现代生物技术的发展，通过有效地分离、纯化、基因表达与重组技术，生产大量的、便宜的酶已成为可能。通过使用新型的酶固定化技术，可明显提高酶的使用稳定性和重复利用率，从而可进一步降低其使用成本。

发明内容

发明目的：

本发明涉及一种固定化漆酶对多环芳烃污染土壤的修复方法，其目的是利用固定化漆酶来降解土壤中的多环芳烃，通过两种不同固定化漆酶的方法，探求在不同的温度和不同的pH条件下，来考查污染物的降解效果。

技术方案：

一种固定化漆酶对多环芳烃污染土壤的修复方法，其特征在于：具体步骤如下：将固定化漆酶用于多环芳烃污染土壤进行修复；土壤采用泥浆，水土比为3:1，溶液部分为HAc-NaAc缓冲液(pH=4)，污染物的初始浓度为100μg/ml；固定化漆酶投入土壤中的量1g/50ml，温度为20~40℃，pH值为4~6，时间为72 h。

对漆酶进行固定的方法如下：

以尼龙网为载体，戊二醛为交联剂，先交联后吸附的固定化方法；具体操作是：将尼龙网剪成0.5cm ×0.5cm~1.5cm ×1.5cm大小的方块，用含质量比15~20%CaCl₂ 和质量比为15~20 %水的甲醛溶液处理15 ~20min，洗净后吸干，于5~8 mol/L HCl中水解40~50 min，洗至pH中性，吸干；尼龙网在质量浓度为5~8% 的戊二醛溶液中交联6~8h 后，加入30U漆酶溶液固定8~10h，用缓冲液清洗，得到固定化漆酶，此时酶回收率为55.56％。

对漆酶进行固定的方法如下：

以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂进行了漆酶的固定化；具体操作是：称取一定量壳聚糖溶于体积比1~5 %冰醋酸，用2~5 mol/L NaOH使壳聚糖沉淀，水洗至中性，抽滤脱水制成湿状壳聚糖载体，然后称取0.1~0.5g壳聚糖与15~20mL与体积浓度为5 %戊二醛交联8~10h 后，加入30.0 U 酶室温吸附固定12~15 h，用缓冲液清洗，得到固定化漆酶，酶回收率为52.24％。

优点及效果：

本发明提出了一种固定化漆酶对多环芳烃污染土壤的修复方法，具有如下优点：

1.成本低：选择壳聚糖作为固定化载体是基于它来源丰富、具有亲水性、生物相容性以及抗微生物分解特性等。选用其作为漆酶固定化载体是基于它在自然界中资源丰富，价格低廉，化学性质稳定，与其它天然材料相比更抗拒微生物分解，具有良好的热稳定性和机械操作性等优点。采用戊二醛作交联剂，戊二醛分子两端的两个醛基可以分别与载体及配基上的氨基以五碳桥的形式交联起来，这一反应条件温和，操作简便，因而应用广泛。尼龙网是由酰胺键联接起来的亲水性载体，与肽键结构非常相似，其价格低廉，化学性质稳定，具有良好的可操作性。

2.效果好：酶可以在较宽的pH、温度及盐浓度范围内处理低浓度或较高浓度的污染物，而微生物一般仅适用于处理较低浓度的污染物。

具体实施方式：