[发明专利]对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种对虾白斑综合症病毒的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

自上世纪九十年代以来，对虾白斑综合症病毒引起世界范围内养殖对虾的急性、致死性传染病，造成对虾养殖业的巨大经济损失。对虾白斑综合症病毒是一种具有囊膜的双链DNA病毒。除了对虾，该病毒也侵染海、淡水中的甲壳动物如蟹和小龙虾等。目前，该病毒引发的对虾疾病已经成为一个世界性的流行性疾病，它不仅是对虾养殖业的一个巨大的威胁，同时也危害到了整个海洋生态环境。对于甲壳动物病毒性疾病，目前还没有有效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的对虾白斑综合症病毒检测技术，不仅能及时预报预测该病毒所致病害的发生，同时也是今后加强科学养殖管理，建立苗种检验检疫体系所必须的。

对虾病毒病检测技术主要包括现场目视观察法、光学显微镜检查法、电子显微镜检查法、免疫荧光检查法等。但这些技术各有其局限性。现场目视观察和光学显微镜检查法不太适用于早期检测，通常在病毒严重感染，产生明显的不可逆转的组织病变时才可得到确证；电子显微镜检查耗时长，费用高并需要特殊的实验器材；免疫荧光检测法操作繁琐，灵敏度低。PCR技术检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作相对简便，目前已广泛应用于对虾白斑综合症病毒的检测。但是这些方法仅是用于病毒的定性检测，不能定量。

由于目前还没有对对虾病毒敏感的细胞系，因此定量检测对虾病毒一直比较困难。最近发展的实时荧光定量PCR技术提供了病毒定量检测的新途径。该技术巧妙地利用了PCR技术的高效扩增，探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR不能定量检测等一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性。Dhar报道了利用SYBR Green定量检测对虾白斑综合症病毒。由于该染料能与所有的DNA双链相结合，对模板没有选择性，所以特异性差，定量相对不准确。王忠发等初步建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测对虾白斑综合症病毒，但是没有制备标准曲线，因此尚未达到真正的定量检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的第二个目的是提供一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有1.5-3g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.3-1.5M，乙二胺四乙酸的浓度为15-25mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为15-25mM,调节pH＝7.5制成试剂A；

试剂B：浓度为20-30mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；

试剂C：体积百分浓度为70-80%的乙醇水溶液；

试剂D：按比例用10倍含MgCl₂的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；

试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ ID NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；

试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’-TET-SEQID NO.3-TAMRA-3’表示；

试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒；

灭菌双蒸水；

DNA吸附柱。

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一：模板的制备：

（1）取待测对虾的鳃丝组织20-50mg，加入500-700μl试剂A，用剪刀充分剪碎；

（2）加入15-25μl试剂B,55℃水浴2-8小时；

（3）转入到一个DNA吸附柱中,12000rpm 1min；

（4）向吸附柱中加入500-700μl试剂C，12000rpm 1min；

（5）再向吸附柱中加入500-700μl试剂C，12000rpm 1min；

（6）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中加入50μl灭菌双蒸水，12000rpm 2min，收集DNA溶液为待测模板；

步骤二：荧光PCR扩增：