[发明专利]用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒，包括阳性抗原、一抗、ELISA酶标板、酶标二抗、稀释液、封闭液、底物显色液、终止液、洗涤液、包被缓冲液，阴性血清，其特征在于： 阳性抗原为核桃蛋白，一抗为抗核桃蛋白多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒，其特征在于阳性抗原核桃蛋白制备方法如下：

1）将石油醚脱脂核桃粉溶解于脱脂核桃粉质量5~10倍的水中，调节溶液pH至10~12，然后在55~60℃水浴搅拌提取1~3h，调节溶液pH值至6.5~7.5进行沉淀；

2）沉淀后溶液进行离心、透析，透析液滤膜过滤，滤液即为核桃蛋白抗原溶液，然后测定蛋白浓度，调整至6~10mg/mL，分装，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒，其特征在于抗核桃

蛋白多克隆抗体的制备方法如下：

1）将纯化的核桃蛋白抗原与弗氏完全佐剂以质量：体积≥0.0001的比例混合乳化15~60分钟，乳化完全后免疫动物，此为基础免疫；

2）之后每隔两周抗原与弗氏不完全佐剂以质量：体积≥0.00005混合、乳化，进行两次加强免疫；第二次加强免疫前，采集血清2mL，ELISA法检测效价；两周后静脉注射纯抗原，冲刺免疫一次；

3）最后一次免疫7天后，按公知的血清制备方法采血，置于37℃恒温箱中2h，4℃过夜，4℃10000g离心，收集上清，即得抗核桃蛋白多克隆抗体，分装，于-20℃以下保存备用。

4.权利要求1所述用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于按如下检测步骤进行：

1）包被：将标准核桃蛋白和样品核桃制品用稀释液分别稀释成为不同的浓度，并加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育2h，4℃过夜；

2）洗涤：弃包被液，在吸水纸上拍干，加洗涤液300μL/孔，微震荡3min/次，洗涤3次；

3）封闭：用含5%脱脂牛奶的PBST封闭液封闭，200μL/孔，37℃孵育2h；

4）洗涤：同步骤2）；

5）加一抗：加稀释过的一抗溶液，一抗溶液的最终效价2³以上，100μL/孔，以正常兔血清为阴性对照，空白只加血清稀释液，37℃孵育1h；

6）之后采用公知的洗涤à加酶标二抗à洗涤à加底物显色液à加终止液àOD值检测等ELISA常规方法进行；

7）建立标准曲线：用不同稀释度的核桃蛋白标准溶液经上述步骤测定得到的OD₄₅₀，建立标准曲线及回归方程；

8）用不同稀释度的核桃制品溶液经上述步骤测定得到的OD₄₅₀中有线性关系的数据代入标准曲线回归方程计算出核桃制品中核桃蛋白的含量，从而可以分析出样品中核桃蛋白的浓度，再根据核桃制品凯氏定氮法测定得到总蛋白含量，即可计算出核桃制品中是否掺有非核桃蛋白以及掺入程度。