[发明专利]一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒及其应用方法

说明书

技术领域

本发明所涉及的一种特异检测鸭黄病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对鸭黄病毒的快速定性检测。

背景技术

 自2010年以来，我国上海、浙江和江苏等地首次出现了鸭黄病毒感染引起产蛋严重下降及蛋鸭的死亡。该病原造成的鸭疫情在世界范围也属首次。同年在湖北省一些养鸭场也出现不明原因的产蛋下降，临床表现为产蛋严重下降甚至停止，并有一定的致死率，剖检病鸭脾脏呈现明显肿大，卵巢肉变，卵泡严重充血，出血。该病的爆发给养殖户带来了巨大的经济损失。

 本课题组对该病进行了系统的流行病学调查、病原分离、动物回归试验、病毒部分基因的测序与分析。证实该疾病是由一种新的黄病毒引起，根据病毒命名的通行规则，参照病毒分离地点，将其命名为HBJL株。初步序列分析结果表明该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属(Flavivirus)蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群（Ntaya virus group, NTAV群）。

鸭黄病毒的基因组为不分节段的单股正链RNA，约由11000个核苷酸组成。在2010年我省蛋鸭群首次爆发产蛋下降疫情时，本课题组进行了大量流行病学调查并进行了病原的分离鉴定工作，参照Tembusu virus NS5 基因序列自主设计了特异性检测引物，将检测出阳性的病料进行SPF鸡胚接种分离出鸭黄病毒湖北毒株HBJL。目前已完成了鸭黄病毒湖北毒株HBJL株部分基因NS5的测定，并提交至美国国家生物信息数据库（NCBI，登录号：JF423123），参考HBJL株的NS5基因设计了引物：

DFV-F:  atgaataaggtggtgaaggtaatgc；

DFV-R： cagattcgtgaaagtgttgagagc；

DFV-P:  catgactgttttcccatcacgtcccgg。产物长度为130bp。

由于该病为动物新发疾病，现有的诊断方法非常有限，多是通过传统的病毒分离培养（Virus Isolation, VI）、聚合酶链扩增法（Polymerase Chain Reaction, PCR）来进行该病的确诊。因此建立一种快速诊断检测方法是个迫切需要解决的问题。

荧光定量PCR（Fluorogenetic Quatitative PCR, FQ-PCR）方法是20世纪90年代中期发展起来的实时定量检测特定核酸的技术，是在普通PCR的基础上增加了一条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现对核酸进行定量检测的。是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一，与普通PCR扩增技术相比具有无法比拟的优点。该技术具有灵敏度高、耗时短、特异性强、无须凝胶电泳、可高通量高效率、定量检测等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用应该荧光定量PCR技术的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法，该试剂盒能够特异灵敏地检测出鸭黄病毒抗原，从而达到快速诊断的目的。

本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)RNA裂解液、b)荧光定量反应液、c)鸭黄病毒强阳性质控品、d)阴性质控品，荧光定量反应液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R 以及荧光探针DFV-P，上游引物 DFV-F序列为:  atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt；下游引物DFV-R序列为： cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt；荧光探针DFV-P序列为:  catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt，荧光探针DFV-P 5＇端标记的是荧光报告基团FAM，3＇端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

按上述方案，荧光定量反应液由1×PCR Buffer, MgCl₂ 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U ,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R为各0.2μM,所述的荧光探针DFV-P 为0.2μM。

按上述方案，所述的鸭黄病毒强阳性质控品为高滴度的鸭黄病毒监利株，其在鸭胚上增殖，经灭活后得到，经测量ELD₅₀为10^3.7/mL。