[发明专利]一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法

权利要求书

1.一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法，所述方法包括下述步骤：

（1）肝素酶粗酶液的制备： 

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天，然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃、150rpm培养2-3天，菌液10000rpm、4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在25mM Tris-HCl缓冲液中，冰浴超声（150W、5s、5s），4℃、10000rpm离心30min，上清即为粗酶液；

 （2）硫酸铵沉淀除杂质：

冰浴中向粗酶加入等体积的溶于10-25mM Tris-HCl 缓冲液的饱和硫酸铵溶液，缓慢滴加，加完后冰浴中缓慢搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min，取上清，冰浴中向其中再缓慢加入干燥的硫酸铵粉末（153g/L溶液）至饱和度70%，搅拌30min，然后18000rpm离心30min，弃上清，将沉淀以25mM Tris-HCl缓冲液适量溶解，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积上述缓冲液过夜透析，得去除杂质后的酶液；

（3）肝素酶Ⅱ的SP柱分离：

将步骤（1）所得粗酶液上一根用10-25mM的Tris-HCl平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的洗脱液，收集液各管随洗脱的进行呈两个分离完全的活性峰靠前的那个为肝素酶Ⅱ，靠后的那个为肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ的混合物；

（4）肝素酶Ⅱ的肝素亲和层析纯化：

步骤（3）肝素酶Ⅱ活性峰洗脱液透析后上一根用5-10mM Tris-HCl缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.1M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析；

（5）肝素酶Ⅱ的CS（Cellufine Sulfate）柱纯化：

步骤（4）得到的酶液上一根用10-50mMTris-HCl缓冲液平衡过的Cellufine Sulfate柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1.5M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析；

（6）肝素酶Ⅱ的SP-HPLC纯化：

步骤（5）得到的酶液上一根用10mM Tris-HCl缓冲液平衡过的SP-HPLC柱，以同样缓冲液中氯化钠线形梯度0-1.0M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶Ⅱ；

其中，步骤（1）所述的种子培养基的组成为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L ，酵母粉 5 g/L，NaCl为5 g/L，pH7.0；

步骤（1）所述的发酵培养基组成为：肝素8g/L, K₂HPO₄ 2.5 g/L, NaH₂PO₄ 2.5 g/L, NH₄Cl 2.0 g/L, MgCl₂ 0.5 g/L, 组氨酸 0.5 g/L, 甲硫氨酸 0.5 g/L, 微量元素（NaMoO₃, CuCl₂, FeCl₂, CoCl₂, MnCl₂, CaCl₂，各1×10^-4M）；

步骤（1）、（2）、（3）、（5）、（6）所述Tris-HCl缓冲液均含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0, 优选pH范围为7.0-7.5。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所用SP层析柱的填料优选使用SP-sepharose FF填料，也可使用其他以SP为分离功能基团的蛋白纯化填料或离子交换树脂。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所用肝素亲和层析柱的填料优选使用键合了肝素的Sepharose 4B，也可使用其他键合了肝素的蛋白纯化填料或离子交换树脂。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述Tris-HCl缓冲液为Tris-HCl溶液，pH6.5-8.0, 优选pH范围为7.0-7.5。