[发明专利]同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法

权利要求书

1.同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，同步检测按照下面步骤进行：

（1）引物设计合成：

（a）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

    （b）分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

     TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

     TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的R=A或G，

     SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’；

 （2）CTAB法提取染病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；

 （3）一步法RT-PCR扩增；

（4）电泳检测；

（5）检测结果分析：根据每对引物扩增片段大小与病毒的关系，观察感染TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的烟草材料或传毒介体昆虫中检测到的不同核酸带，判断发病烟草或传毒介体昆虫中具体感染的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV 病原物的种类。

2.根据权利要求1所述的同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述CTAB法提取感病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，步骤如下：

第一步、样品准备

（1）感病植物组织准备：将3~5片病叶叠加在一起，称取50~100 mg至研钵中；

（2）传毒介体昆虫准备：取30~50头蚜虫至研钵中；

第二步、加入1.2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH 8.0的100 mM的Tris-HCl、1.4 M的 NaCl和20 mM 的EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2％巯基乙醇；

第三步、恒温处理：充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65℃温浴下处理15~60 min；

第四步、离心处理：首先，将离心管放入离心机中12000~13000 r/min离心处理15 min，取750 μL上清液至另一1.5 mL的离心管，加入750 μL体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，涡旋震荡混匀30 s；然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中12000~13000 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 μL上清液至又一1.5 mL的离心管中，并加入600 μL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中12000~13000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 μL 70% 的乙醇，并放入离心机中12000~13000 r/min离心处理10 min； 

第五步、干燥：用微量移液器吸出液体，沉淀部分在20℃~25℃条件下自然干燥10~15 min；

第六步、溶解：加入100 μL 20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打5~10次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存备用；或者将所获得的总核酸以干粉状态放入-80℃进行长期保存备用。