[发明专利]一种新型、有效的启动子探针构建及在产酶溶杆菌组成型强启动子克隆中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种新型、有效的启动子探针构建及在产酶溶杆菌组成型强启动子PB500克隆中的应用。 

(二)背景技术

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)是溶杆菌属(Lysobacter)的模式种，属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)，该菌菌落黏性、黄色、富含G+C％、有滑行能力，能产生蛋白酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶，纤维素酶等多种胞外酶，对真菌、卵菌和线虫等多种植物病原物都有很好的拮抗活性。 

目前，仅有4株产酶溶杆菌菌株(3.1T8、N4-7、C3和OH11)被报道应用于植物真菌或卵菌病害的生物防治。菌株3.18T对植物病原真菌及多种腐霉菌都表现出强烈的抑制作用；菌株N4-7能有效防治由Magnaporthe poae引起的草皮草叶斑病；C3菌株能防治草坪草褐斑病(病原为Rhizoctonia solani)、酥油草叶斑病(病原为Bipolaris sorokiniana)以及菜豆锈病(病原为Uromycesappendiculatus)。此外，Ozlem&Yuen(2003)曾报道，C3菌株具有诱导草坪草对褐斑病菌的抗性。OH11菌株分离于辣椒根际土壤，是国内首次报道的一株生防细菌菌株。该菌株对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜腐霉(Pythiumultimum)、辣椒疫霉(phytophthora capsici)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麦赤霉病菌(Fusarum solani)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)等多种植物病原物均具有强烈的拮抗活性。在温室盆栽试验中，OH11对辣椒疫病防治效果达到了83.6％。然而，到目前为止，仍未见产酶溶杆菌防治植物细菌病害的报道。 

细菌的QS(Quorum sensing)系统是细菌通过分泌可溶性信号分子(autoinducer，AI)来监测群体密度并调控细菌生物功能的信息交流机制。当种群密度达到一定阈值时，细菌通过细胞内受体感知AI的存在，随着种群密度的增加，环境中积累的AI信号分子的浓度也成比例地增高，当达到一定阈值水平时细菌作出反应，对这些信号分子进行检测，在群体范围内调控一系列相关基因的表达。研究表明，大多数革兰氏阴性细菌利用酰基高丝氨酸内酯(AHL)类信号分子来调控细菌的多种生理生化功能，包括细菌毒性、接合、色素的形成、抗生素的产生和生物膜的形成。 

已有大量数据表明，多数革兰氏阴性植物病原细菌均利用AHL类信号分子来调控自身在寄主植物上的致病性。这些细菌包括大白菜软腐病菌(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum)、西瓜果斑病菌(Acidovoraxavenae subsp．citrulli)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、梨火疫病菌(Eamylovora)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp．stewartii)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等，在这些植物病原细菌中，敲除AHL类信号分子的编码基因即luxI的同系物，所构建的突变株丧失或者显著降低AHL的产生能力，使病菌丧失或显著降低在寄主植物上的致病性。因此，通过干扰或破坏植物病原细菌的QS系统即群体淬灭(Quorum quenching，QQ)，降低病原细菌在寄主植物上致病性，可以作为防治植物细菌病害的一种新机制。 

细菌的群体淬灭是指干扰或者破坏细菌QS的过程。目前，细菌QQ机制中研究最为深入的是酶解机制，即利用相关酶类来降解细菌QS信号分子，起到干扰或破坏细菌QS的目的。在现有报道的降解酶中，研究最为透彻的是AiiA蛋白。该蛋白最早分离于Bacillus sp．24菌株，能够降解不同碳链分子的AHL类信号分子。将外源的aiiA基因转入软腐病菌(Pectobacterium carotovorum)能显 著降低该菌在大白菜和马铃薯上的致病性。转aiiA基因的大白菜和马铃薯能大幅度提高对软腐病菌的抗性。此外，转aiiA的生防细菌，如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、伯克氏菌KJ006(Burkholderia sp.KJ006)，均能大幅度降低软腐病菌在寄主植物上的致病性。