[发明专利]一种石斛多糖含量的测定方法及其应用

权利要求书

1.一种石斛多糖含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL^-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；

换算因子的测定：取50μg·ml^-1石斛精多糖溶液0.05～1ml，加蒸馏水补足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C，其中，Cs为石斛精多糖溶液的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液的浓度；

石斛样品溶液中石斛多糖含量的测定：吸取石斛样品溶液0.05～1ml，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程计算石斛样品溶液中石斛多糖的浓度，由下述公式计算石斛样品溶液中石斛多糖含量X：X=f×C’×D×100%/W；

式中：f--换算因子，C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--石斛干燥粉末测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末的质量。

2.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：所述的石斛样品溶液采用以下方法进行制备：将石斛粉末按质量体积比1g/100～150ml加入80wt%乙醇中，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣；往滤渣中按质量体积比1g/100～150ml加入蒸馏水，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，用蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到石斛样品溶液。

3.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：所述的石斛精多糖采用以下方法进行制备：

取石斛粉末，按质量体积比1g/10～15ml加入石油醚，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣A；按质量体积比1g/10～15ml往滤渣A中加入80wt%乙醇，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣B；于60℃将滤渣B烘干，得到脱脂干粉；按质量体积比1g/10～15ml往脱脂干粉加入蒸馏水，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，浓缩，收集浓缩液；往浓缩液中加入预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，静置过夜，离心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖；

取石斛粗多糖，配制成40mg·ml^-1的石斛粗多糖溶液；按体积比0.4：1往40mg·ml^-1石斛粗多糖溶液中加入1mg·ml^-1的胰蛋白酶，得到混合液，37℃恒温处理5h后于95℃灭活5min，加入Sevag溶液，常温震荡培养5min后于10℃、3500rpm离心5min，保存上层溶液，取下层溶液，加入Sevag溶液，重复振荡培养和离心操作3次，合并上层溶液，用蒸馏水过夜透析后加入4℃预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，静置过夜，离心，收集沉淀，干燥，得到石斛精多糖。

4.根据权利要求3所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：

所述的浓缩于60℃减压浓缩至20～50ml；所述的离心的条件为于4℃、12,000rpm离心5min。

5.根据权利要求3所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：所述的Sevag溶液采用以下方法进行配制：将氯仿和正丁醇按体积比为4：1混合均匀，得到Sevag溶液。

6.根据权利要求3所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：所述的Sevag溶液的体积为所述的混合液的体积的1/3。