[发明专利]一种提取及培养间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种提取及培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞最初在骨髓中发现，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞，包括骨膜、松质骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中等，因其具有多向分化潜能、支持造血和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。自从2001年发现脂肪来源干细胞以来，由于其具有数量巨大，对患者损伤较小，获取相对容易，更重要的是脂肪间充质干细胞不易受到肿瘤细胞污染，更容易进行体外净化，病人可以用自体细胞，并且移植细胞更易被患者自身组织所接受，更快的整合到自身组织系统以发挥作用，克服来自骨髓或者脐带血所存在诸如难以收集、成本高以及必须通过组织相容性验证发现合适匹配的缺陷，同时避免了一系列的伦理问题和异体细胞的免疫排斥等移植副反应，所以在临床应用上有极大的优势和广阔的前景。

目前，从脂肪组织提取间充质干细胞一般通过水浴酶消化30～60分钟，一次性离心收集单个核细胞，并进行贴壁培养去除红细胞等非贴壁细胞，从而得到较纯的间充质干细胞，然而，这种一次性酶消化得到的间充质干细胞的数量和质量往往不能同时保证，消化时间过短不能从组织中完全解离单个干细胞，消化时间过长，最初解离出的单个干细胞受到消化酶的过渡作用，对细胞状态造成伤害，最终得到的间充质干细胞状态好坏不均，为了防止消化酶的过度作用以得到良好的匀质细胞就必须通过对大量的脂肪组织(一般需要200ml以上)短时间作用，因此，为了保证从脂肪中成功提取间充质干细胞需要大量的脂肪组织，这就需要通过无菌条件下湿性抽脂法抽取200ml以上脂肪，抽脂过程中需要大面积的局部麻醉，并在抽脂部位切一个口，导致患者抽脂面积较大，手术时间较长，出血较多或导致发热现象，如果后期护理不好容易引发炎症对病人造成一定的创伤和痛苦。所以急需改进脂肪间充质干细胞的提取技术，减少脂肪组织的用量，以减少抽脂过程对病人造成的痛苦。

目前，间充质干细胞体外扩增培养体系中一般都含有一定浓度的胎牛血清，使用浓度至少10％才能保证细胞的正常生长传代。然而，间充质干细胞在高浓度血清培养时，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基方案，但间充质干细胞在无血清培养基中普遍存在生长缓慢，多向分化能力逐渐消失的问题，为了提高细胞的增殖速度必须通过添加大量的非血清添加剂，例如CNI02634482A(专利申请号201210010246.8，申请公布日2012.08.15)添加了近十种成分，完全培养基的配置费时费力，且培养状态容易受单一成分的影响，至今无血清培养基仍未能获得重大突破。所以，急需开发一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。

发明内容

本发明提出一种提取及培养间充质干细胞的方法，解决了现有技术必须从200ml以上脂肪组织才能提取干细胞的问题，大大降低了提取成本，同时将病人的创伤降到接近零，二是避免了使用胎牛血清带来的各种弊端，且解决了现有技术中完全培养基的配置费时费力，且培养状态容易受单一成分的影响，质量低的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括下列步骤：

1)将150～250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2～8℃保存；

2)将上述制得的抗凝血1500～2100r/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2～8℃下保存1～7天备用或在-75～-85℃下长期保存备用；

3)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；

4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；

5)用质量浓度为0.05～0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后的脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5∶1～2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟振荡该悬液；