[发明专利]随机光学重建荧光显微镜及其实现方法

说明书

技术领域

本发明关于一种提供高于传统光学衍射极限分辨率(200nm)的随机光学重建荧光显微镜及其实现方法，特别是涉及一种利用宽谱光源作为荧光分子活化光源，基于单荧光分子检测和中心定位技术的超高分辨率的随机光学重建荧光显微镜及其实现方法。

背景技术

传统荧光显微镜在生物和医学研究中发挥着重要的作用，是生命科学研究的必备工具。但是，传统光学显微镜的分辨率受光学衍射极限的限制，难以实现高于200nm的分辨率。近年来，哈佛大学及其它大学的几位学者提出可以将荧光分子活化与单分子中心定位技术相结合，突破光学衍射极限，实现纳米尺度的分辨率(20-50nm)。

这种技术的核心是通过特定波长的光照射使荧光分子发光并且进入暗态，然后用另一波长的活化光使暗态的荧光分子活化重新具备发光的能力，通过控制活化光的功率密度，使得成像区域中随机恢复的荧光分子之间的距离大于光学衍射极限，从而能被传统光学显微镜分辨。连续记录这些单个荧光分子的图像，并进行单分子中心精确定位，最后通过重建获得具有纳米尺度分辨率的荧光图像。

对于传统的商业或研究用随机光学重建显微镜(STORM)，一般的激发光光源和活化光光源都用激光器，通过声光可调滤光器(AOTF)的控制进行激发光和活化光的照明。然而，这种方法的缺点是激光器或声光可调滤光器的价格比较昂贵，成本较高。

发明内容

基于随机光学重建的概念，同时为了克服现有超高分辨率显微镜的复杂性和高成本，本发明之目的在于提供一种新的随机光学重建荧光显微镜及其实现方法，其通过外置照明系统与荧光显微镜组合，将普通倒置荧光显微镜改造为一台提供纳米分辨率的超高分辨显微镜，且其成本大大低于商品化的同类显微镜产品。

为达上述及其它目的，本发明提出一种随机光学重建荧光显微镜，包括用于放置样品的载物台，紧挨该载物台下方设置物镜，另外，该显微镜还包括：

双滤光片层，设置于该载物台下方，包含两层电动转换的滤光片盒，一层用于走活化光路，一层用于走激光光路；

活化光光源产生模块，用于产生活化光，产生的活化光经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的一层电动滤光片盒的二向色镜及该物镜后照在该载物台的样品表面进行照明，提供活化光；以及

激发光光源产生模块，包括激光产生器、扩束装置及聚焦装置，该激光产生器产生的激发光，经过该扩束装置扩束、该聚焦装置聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照在该载物台的样品表面进行照明，提供激发光。

进一步地，该活化光光源产生模块的光源利用汞灯或金属卤素灯或LED灯产生。

进一步地，该光源经过显微镜自带通道，扩束、聚焦后，从上层右口导入，经上层电动滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供活化光。

进一步地，该上层电动滤光片盒中的二向色镜周期性转换，提供周期性的活化光。

进一步地，该显微镜利用一电动快门加在活化光源前以提供周期性的活化光。

进一步地，该激光产生器为半导体激光器，该半导体激光器经过扩束、聚焦，从该显微镜的后口进入该显微镜，经底层滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供激发光。

进一步地，该显微镜于成像过程中，通过红外光照在样品表面反射回的信息对物镜的高度做实时调整，以防止因样品漂移而产生垂直方向失焦现象。

为达到上述及其他目的，本发明还提供一种随机光学重建荧光显微镜的实现方法，用于改造普通单滤光片层的倒置荧光显微镜，包括如下步骤：

增加一层电动转换的滤光片盒以形成双滤光片层；

活化光光源产生模块产生活化光光源，经过扩束、聚焦后，经该双滤光片层的一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照在载物台的样品表面进行照明，提供活化光；以及

激发光光源产生模块利用激光产生器产生激光光光源，经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照在该载物台的样品表面进行照明，提供激发光。

进一步地，该活化光光源产生模块的光源利用汞灯或金属卤素灯或LED灯产生，该光源经过该显微镜自带通道，扩束、聚焦后，从上层右口导入，经上层电动滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供活化光。

进一步地，该激光产生器为半导体激光器，半导体激光器经过扩束、聚焦，从显微镜的后口进入显微镜，经底层滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供激发光。