[发明专利]一种夹心型电化学免疫传感器、其制备方法及其用途

权利要求书

1.一种夹心型电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖分散的氮掺杂石墨烯、戊二醛、一抗、牛血清蛋白、肿瘤标志物抗原和哑铃型Pt-Fe₃O₄纳米粒子孵化的二抗，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。

2.一种权利要求1所述的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，所述方法包括如下步骤：

a、合成氮掺杂的石墨烯；

b、制备哑铃型Pt-Fe₃O₄纳米粒子孵化的二抗(Ab₂)溶液；

c、制备电化学免疫传感器工作电极；

d、制作电化学免疫传感器工作曲线。

3.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤a合成氮掺杂的石墨烯包括以下步骤：

① 氧化石墨烯的合成：将质量比1:9的石墨和高锰酸钾混合，放入带有磁子的三口瓶中，然后加入体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴，加热到50 ℃，反应12 h之后，将样品倾倒在冰上，加入过氧化氢，磁力搅拌0.5 h；反应结束后，将得到的混合物离心、洗涤、弃去上清液，经干燥后得到棕黄色固体粉末氧化石墨烯；

② 氮掺杂石墨烯的合成：称取上述步骤①制备的氧化石墨烯溶于水后，用30%的氨水调节其pH=10.0，加入水合肼，其中所述水合肼与氧化石墨烯溶液体积比为1:35，室温磁力搅拌10 min，转移至高压釜，120 ℃条件下反应12 h，得到的混合液，离心洗涤，洗到中性，室温真空干燥，得到氮掺杂石墨烯。

4.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤b制备哑铃型Pt-Fe₃O₄纳米粒子孵化的二抗溶液包括以下步骤：

① 在不断流动的氩气环境中，将物质的量之比为1:3:3:30的乙酰丙酮铂(II)、油酸、油胺和正十八烷混合；

② 将上述混合溶液以恒定的速率加热到120 ℃，然后加入Fe(CO)₅，其中，所述Fe(CO)₅与乙酰丙酮铂(II)的物质的量之比为4:1，温度升高至280 ℃并保持20 min；

③ 将所得到的混合溶液用过量乙醇沉淀，然后离心10 min，再将制备的沉淀物溶解在正己烷中，并用乙醇反复洗涤、离心；

④ 将上述得到的产品溶解在甲苯中，然后真空干燥，即可得到哑铃型Pt-Fe₃O₄纳米粒子固体；

⑤ 将称取好的上述Pt-Fe₃O₄纳米粒子加入到CTAB溶液中，二者的质量比为1:18，超声0.5 h，离心15 min后加入Ab₂和pH= 7.4的PBS缓冲溶液，在4℃震荡24 h，得到哑铃型Pt-Fe₃O₄纳米粒子孵化的二抗溶液。

5.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤c制备电化学免疫传感器工作电极的方法包括以下步骤：

① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；

② 用质量分数0.5%的壳聚糖溶液为溶剂配制浓度为1 mg/mL的氮掺杂石墨烯溶液，然后将所述氮掺杂石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；

③ 将戊二醛滴到电极表面，并保持湿润放置1 h左右，在电极半干的时候滴上1 mg/mL的一抗溶液，晾干；

④ 再在电极表面修饰质量分数为1%的BSA溶液以消除电极的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液；

⑤ 将Pt-Fe₃O₄预先孵化好的二抗溶液修饰到电极上，在4 ℃保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。

6.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤d制作电化学免疫传感器工作曲线的步骤如下：

① 将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；

② 含0.1 mol/LKCl作为支持电解质的pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测修饰好的工作电极对过氧化氢的响应；根据所得电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。