[发明专利]具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程菌及其构建方法与应用，特别涉及具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。

背景技术

我国是以种植业为基础的农业大国，许多重大病害，如灰霉病、炭疽病、番茄叶霉病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病等对农业生产造成了严重损失。每年通过使用农药可减少经济损失达300亿元左右，但化学农药施用量占农药用量的80%以上，造成严重的环境污染、农药残留、抗性增加等，严重威胁着人类的健康和生态环境。因此，生物防治是农药发展的必然趋势。微生物及其代谢产物具有高度专一性，杀虫效率高，不杀伤天敌，且容易降解，无残留，对人畜无毒，能增强植物的抗病性，刺激植物生长，同时能够有效缓解化学农药带来的抗药性等优点。近几年微生物农药在生产上的推广应用，已经产生了巨大的经济效益、社会效益和生态效益，目前已被很多国家列入国家重点科研规划。

根据用途和防治对象的不同，用于生物防治的微生物种类也很多样，其中放线菌由于次生代谢产物丰富而广泛应用于农业生物防治中，放线菌的代谢产物——抗生素在医疗、饲料及农业生产中做出了很大贡献。放线菌的生防作用主要是通过重寄生作用，竞争作用，分泌抗生素、酶及其他次生代谢物质等方式抑制病原真菌的生长。目前，关于链霉菌的研究主要集中于其次生代谢产物的分离鉴定、抗生素合成代谢调控、产品开发等方面的研究，关于生防菌的多功能性研究得比较少。但是，作为天然菌株，单一菌株的代谢产物种类有限，会出现抑菌机制单一，抑菌能力差，抑菌谱窄等现象，将两种或者几种活性物质共同作用于病原菌，可以产生协同效应，很好的抑制病原菌的生长。

利迪链霉菌（S.lydicus）A02是分离自北京郊区的一株产纳他霉素的放线菌，该菌具有较强的抗真菌活性,对灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病菌（Alternayiasolani）、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearium)、番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）、芹菜斑枯病菌（septoria apiicola）、大葱紫斑病菌（Alternaria poprri）、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)等多种植物真菌性气传病害的病原菌有明显的抑制作用，为了开发防效更好的植物病害生防制剂，需要研发抗菌活性更高的新菌株。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供构建对植物病原真菌的抗菌活性高于宿主利迪链霉菌的重组利迪链霉菌（基因工程菌）的方法，该重组利迪链霉菌具有纤维素酶活性。

本发明所提供的构建具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的方法，包括将SEQ IDNo.1所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的步骤。

上述方法中，所述纤维素酶的编码基因的编码序列为SEQ ID No.2的第14-1495位。

上述方法中，所述纤维素酶的编码基因通过所述纤维素酶编码基因的表达载体导入作为宿主菌的利迪链霉菌中，所述纤维素酶编码基因的表达载体中启动所述纤维素酶编码基因转录的启动子是红霉素抗性基因启动子。

在本发明的一个实施例中，所述红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列是SEQ IDNo.3。

上述方法中，所述将SEQ ID No.1所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤：将所述纤维素酶编码基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌。

在本发明的实施例中，所述纤维素酶活性体现为降解羧甲基纤维素钠。

在本发明的实施例中，所述纤维素酶编码基因的表达载体为将所述纤维素酶的编码基因插入pIB139的所述红霉素抗性基因启动子下游得到的重组表达载体，具体是将SEQ ID No.2所示的DNA片段经NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和EcoRI位点得到的重组表达载体pIB139-glu。

在本发明的实施例中，所述作为宿主菌的利迪链霉菌可为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02CGMCC No.1654，所述大肠杆菌为去甲基化E.coliET 12567(pUZ8002)。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供由上述任一种方法得到的重组利迪链霉菌。