[发明专利]检测黄热病毒的试剂及检测黄热病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测黄热病毒的试剂及黄热病毒的检测方法，尤其涉及利用等温扩增技术检测黄热病毒的方法。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus，YF)属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员，是引起人类黄热病的病原体，该病主要流行于非洲及南美洲，经蚊传播的急性传染病，属于国际检疫、监控的3种传染病之一。人对该病毒普遍敏感，不分年龄、性别和种族。黄热病一般呈散发，如果媒介蚊虫大量繁殖，感染能在人群中引起流行，在某些暴发疫情中病死率可高达20％-40％，危害极大。WHO原希望到2015年能在全球彻底消灭黄热病，但根据2009年的估计材料，全球每年仍可出现20.6万病例，其中四分之一病例死亡。随着我国改革开放以及对外交流的增多，特别是我省对外贸易的不断增加，不能排除该病毒随外来人员或媒介传人我国的可能，所以，黄热病毒的检疫需要快速敏感的检测手段。

一般来说，用动物或细胞培养分离病毒最为可靠，但费时，费力，常用的血清学方法对少量病毒抗原的检测敏感度不够高。这些方法已经愈来愈跟不上人类对致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。由于核酸检测技术具有快速、灵敏等优势，已经成为了目前病原检测最常用的方法之一。特别是PCR技术，能对微量样本进行快速扩增，但由于PCR反应分为解链、退火和延伸三个阶段而且只有延伸阶段进行DNA扩增，其扩增效率和速度受到很大影响，而且特异性、操作的简易性都存在不足之处，特别是对试剂、昂贵仪器的严格要求和必须专业人员操作等因素，大大地限制了其在基层单位和现场检测中的应用。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)依赖于4条能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。因此该方法具有很高的推广应用价值，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员进行常规和应急检测的工具。除了进行DNA检测之外，在反应体系中加入逆转录酶后，还可以通过RT-LAMP(逆转录-环介导的等温扩增)方法从模板RNA开始进行检测。逆转录和等温扩增在相同温度下一步完成，很大程度上提高了检测的灵敏度并节省了反应时间。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种检测黄热病毒的试剂，可以用于快速准确地检测黄热病毒，从而能够建立适于口岸卫生检疫的黄热病毒检测方法。为此，本发明采用以下技术方案：它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；引物基因序列如下：

外引物F3:TGGGAGAGGAGATTCACGT；

外引物B3:TCAAGCCGCCAAATAGCC；

内引物FIP:

CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；

内引物BIP:

AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。

本发明另一个目的是提供一种恒温扩增检测黄热病毒的方法，可以快速准确地检测黄热病毒。为此，本发明采用以下技术方案：

所述方法的反应体系为25μl：20mmol/l Tris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH4)₂SO4，8mmol/l MgSO₄，0.1％Tween-20，外引物与内引物浓度比例为1:8，外引物F3与B3均为5pmol/l，内引物BIP与FIP 40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10UAMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μlRNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl。反应温度选择63℃。

所述方法的步骤为：将阴性对照、阳性对照和待测样本分别按上述反应体系孵育63℃1小时进行反应，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用黄热病毒疫苗株；反应结束后，进行以下三种试验中的至少一种：

1）、取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，检测样本孔中如产生阶梯状条带则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

2）、反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；