[发明专利]旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物分离、纯化富集装置，尤其是一种高效分离纯化、富集旗肽D-tag标签重组蛋白的免疫亲和纯化富集柱的制备方法及其应用。

背景技术

分子生物学及蛋白质组学是生命科学研究领域的热门学科，重组蛋白质的使用在近年来大大增加。为方便基因重组蛋白的标记、追踪、鉴定和纯化，在目标蛋白表达中会人为引进一段标签多肽形成重组蛋白。因此分离纯化、富集重组蛋白的技术越来越显示其重要性。从成份复杂的表达体系中分离纯化、富集目标蛋白是一项艰巨而繁重的任务，而亲和层析法是目前最广泛的分离纯化、富集重组蛋白的方法。

由于目前用于分离纯化、富集D-tag重组蛋白的亲和层析柱主要有金属螯合亲和柱以及利用酶的底物、反应性燃料为配基的亲和柱，这些亲和柱存在非特异性吸附、洗脱条件剧烈、提纯效果不佳等显著缺点，而且金属螯合亲和柱还存在金属离子脱落到洗脱液中的缺陷，这些都将限制分离提纯出来的目标蛋白后续的应用、检测。D-tag作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。因此现D-tag标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、特异性分离纯化、富集D-tag标签重组蛋白的免疫亲和纯化富集柱制备方法及其应用。

为达上述目的，本发明2次采用抗原抗体的特异性反应和可离解的特性Ag + Ab (固相)                                                 Ag-Ab （固相）原理，具体如下：

首先利用这一原理将D-tag短肽半抗原偶联于Agarose上制得D-tag- Agarose亲和柱，用于提取D-tag特异性多克隆抗体。

再利用这一原理将提取所得的抗D-tag特异性抗体Anti-D-tag偶联到Agarose上制得Anti-D-tag- Agarose免疫亲和柱，用于分离纯化、富集细胞裂解液中的D-tag标签重组蛋白。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：

1）将免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体采用流式过柱的化学偶联反应偶联到过碘酸钠氧化的琼脂糖Agarose上，用硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液PBS清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干PBS后加入等体积甘油，混匀，得到D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料；

2）将D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料装入塑料柱中，按需要的体积装柱，即得所述的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱。

所述方法制备的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱，包含偶联有免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该免疫亲和填料的塑料柱。

所述免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体，是用D-tag短肽偶联活化的载体蛋白制得免疫原免疫动物，得到含抗体血清，将含抗体血清上到偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱，清洗未结合的杂质，用弱酸洗脱下D-tag特异性多克隆抗体，脱盐、冻干备用。

所述的 D-tag肽是由8个氨基酸即天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸组成的短肽，采用这8个氨基酸残基分成2组以相反方向引入半胱氨酸巯基SH基团制得巯基化的D-tag短肽，其序列为：1）半胱氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸即C-DDDK,2) 天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸即DYKD-C。见序列表。

所述的D-tag短肽偶联活化的载体蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸钠SDS变性血蓝蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用载体蛋白，再与碘乙酰-羟基琥珀酰亚胺酯即碘乙酰-NHS反应生成碘乙酰化 KLH或OVA ；通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉过量的碘乙酸后，将巯基化D-tag短肽与碘乙酰化的KLH或OVA混合，调pH=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。

所述偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱，是将2种方向相反巯基化的D-tag短肽半抗原与碘乙酰化的Agarose反应，形成化学共价键复合体填料D-tag-Agarose,将D-tag-Agarose装柱即得偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱。