[发明专利]一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法。

背景技术

森林葱蜗牛Cepaea nemoralis (Linnaeus) 是国际植物检疫中倍受关注的危险性有害生物，其贝壳与同属的花园葱蜗牛Cepaea hortensis Müller等近似种极为相似，往往难以区分，且只有资深的陆生贝类学分类专家才能鉴别，卵粒和幼螺的鉴定则更为困难。由于历史的原因，目前国境口岸的植物检疫员多为植物保护专业，对陆生软体动物的分类知之甚少，这种局面给我国的实际检疫工作造成了被动，也是世界各国检验检疫部门共同面临的技术难题。最近二十多年来，分子系统学飞速发展，即由基因序列的比较可以厘清物种的分类学与系统学地位。因此可以将形态和分子特征结合起来，对森林葱蜗牛及其近似种的分类学进行更为深入而详尽的研究，为森林葱蜗牛的快速准确鉴定提供新的技术手段。而PCR技术在国境口岸检疫部门已经相当普及，如果能设计出特异性引物用PCR扩增方法进行初筛或鉴定，这个难题就迎刃而解。本发明建立了一种PCR方法检测鉴定森林葱蜗牛的技术，以适应当前国境口岸检疫工作的需要。

发明内容

本发明针对传统形态学鉴定技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种准确性好、灵敏度高、成本低廉的检测方法，应用于森林葱蜗牛的快速检测鉴定。

本发明提供了一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，所述方法是应用特异性引物对森林葱蜗牛的分子特征进行识别，所述引物为：

上游引物为CN-(P1)：5’- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3’，

下游引物为CN-(P2)：5’- GTCAACATCTATCCCAAC -3’。

本发明的PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Taq PCR MasterMix混合液12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，余下用灭菌ddH₂O补足。

所述PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃ 50s，52℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 延伸10min，结束反应。

本发明的显著优点：本发明方法能够快速、准确地检测鉴定森林葱蜗牛。本发明为植物检疫中对危险性有害生物森林葱蜗牛的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止森林葱蜗牛的传播和扩散具有重要意义。本发明所提供的一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法具有以下有益效果：

1、结果可靠：本发明所设计出的一种鉴定森林葱蜗牛的特异性检测引物，仅针对森林葱蜗牛进行检测，已经对花园葱蜗牛Cepaea hortensis；散大蜗牛Helix aspersa；盖罩大蜗牛Helix pomatia；斯文豪大蜗牛Nesiohelix swinhoei；灰尖巴蜗牛Bradybaena (Acusta) ravida ravida；地中海白蜗牛Cernuella virgata进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证。

2、特异性强：所采用的引物是针对森林葱蜗牛的CO I基因序列设计出的特异性引物，特异性高。

3、灵敏度高：对森林葱蜗牛的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/μL。

4、实用性好：当传统分类学方法难以鉴定森林葱蜗牛时，本发明方法用分子生物学技术进行弥补，从而得到快速、准确、灵敏度高的检测鉴定森林葱蜗牛的PCR方法。因此本方法的实用性强，可满足对森林葱蜗牛进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

附图说明

图1为森林葱蜗牛PCR引物特异性试验结果。 其中：M为100bp DNA ladder Marker；泳道1为森林葱蜗牛Cepaea nemoralis；泳道2为花园葱蜗牛Cepaea hortensis；泳道3为散大蜗牛Helix aspersa；泳道4为盖罩大蜗牛Helix pomatia；泳道5为斯文豪大蜗牛Nesiohelix swinhoei；泳道6为灰尖巴蜗牛Bradybaena (Acusta) ravida ravida；泳道7为地中海白蜗牛Cernuella virgata。