[发明专利]稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型及其建立方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及体外高通量药物筛选领域，特别是涉及一种稳定表达人心肌细胞I_ks的CHOK1细胞模型及其建立方法与应用。

背景技术

离子通道是细胞膜上的蛋白质孔道,离子的跨膜流动是细胞传递信息的基础。钾通道是一类普遍存在的膜蛋白,在很多的生理过程中扮演着极为重要的角色。缓慢激活延迟整流钾电流（I_ks）对于控制心脏电生理活动有着重要作用，参与人心肌细胞动作电位复极，特别是平台期形成与维持的重要外向离子流。I_ks通道是由KCNQ1基因编码的α亚基单位，以及KCNE1基因编码的β亚基单位组成的。

I_Ks其亚基上的基因突变，会引起I_ks功能异常，是多种恶性心律失常的重要原因，深入研究I_ks通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治提供新线索。由于人心肌细胞I_ks电流密度小，存在多种电流成分干扰，以及组织标本来源困难等原因，直接利用人心肌细胞对药物的高通量筛选来说不是最佳选择，因此建立体外的稳定表达的I_ks细胞模型具有很大的价值，有利于药物的稳定高效筛选。

中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）是来源于中国仓鼠卵巢的细胞系，应用于生物和医学研究以及应用于商业化的治疗蛋白的生产。CHO-K1细胞作为生物制药生产的主要宿主细胞，具有高增长率，高产率，易于遗传操作，本身表面离子通道少，干扰少等特点，所以更适用于表达外源离子通道蛋白，用于药物筛选。

电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。传统的手动膜片钳技术虽然能够很好的研究细胞表面离子通道的作用，但是其人力资源耗费大，且通量小，效率低，不能进行大量的克隆筛选以及药物化合物的筛选，所以很难成为细胞克隆初期筛选的最好的实验方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种稳定表达人心肌细胞I_ks的细胞模型，它有利于药物的稳定高效筛选。

为解决上述技术问题，本发明的稳定表达人心肌细胞I_ks的细胞模型，以CHO-K1细胞为宿主细胞，包含有KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位。

本发明要解决的技术问题之二是提供上述细胞模型的建立方法。

为解决上述技术问题，本发明的稳定表达人心肌细胞I_ks的细胞模型的建立方法，步骤包括：将KCNQ1和KCNE1质粒分别连接到载体上，然后转染入CHO-K1细胞。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述细胞模型在药物体外高通量筛选中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1．本发明通过将组成I_ks通道的KCNQ1基因编码的α亚基单位以及KCNE1基因编码的β亚基单位共同转染到CHO-K1细胞中，在细胞内共表达，发挥通道功能，成功建立了体外稳定表达KCNQ1/KCNE1的CHOK1细胞模型，对进行体外药物高通量筛选带来了许多便利。

2．本发明使用膜电位试剂盒，通过FLIPR检测荧光信号值，能够快速、高效地筛选表达通道且有通道功能的阳性克隆，为电生理实验提供更有针对性的克隆“候选者”，从而节省了大量的时间和人力，是一种很好的高通量筛选途径。

附图说明

图1是FLIPR检测得到的反应信号图。

图2是手动膜片钳在CHOK1-KCNQ1/KCNE1细胞上记录到的CHOK1/KCNQ1原始电流图。

图3是手动膜片钳记录到的KCNQ1/KCNE1通道的电流-电压关系曲线。

图4是在手动膜片钳验证中，KCNQ1/KCNE1通道的选择性抑制剂Chromanol（色原烷醇）抑制了KCNQ1/KCNE1通道的电流。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合图示的实施方式，详述如下：

实施例1

（一）质粒载体构建

1．全基因合成KCNQ1和KCNE1，在基因5’末端引入酶切位点EcoRI，3’末端引入酶切位点HindIII。