[发明专利]利用酿酒酵母稳定表达重组人血清白蛋白-人甲状旁腺激素(1-34)ab二联体融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程制药技术领域，是包括用DNA重组技术合成人血清白蛋白-人甲状旁腺激素基因、含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主、制备融合蛋白的方法。 

技术背景

甲状旁腺激素(human Parathyroid Hormone，hPTH)是由人甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，成熟hPTH含84个氨基酸残基，分子量约为9.5kD，是人体内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一。小剂量、间歇性应用hPTH对骨质疏松症有一定的治疗效果。 

作为一种蛋白类药物，分子量若小于20kD在代谢过程中就易被肾小球滤过，导致体内半衰期较短，为了达到治疗效果，一般需要频繁或大剂量用药，给患者带来极大的不便。因此长效蛋白药物的开发已成为对第一代基因工程产品进行二次开发的一个重要方向，而增加其分子量则是一个通用的策略。由于人血清白蛋白(HSA)是一个稳定的“惰性”蛋白，同时也是许多内源因子和外源药物的载体，药物与其融合后，可以减缓自身的生物利用速度，延长在体内的半衰期达19d之久。 

陈静等在毕赤酵母中表达HSA-hPTH(1-34)融合蛋白，检测到HSA-hPTH(1-34)具有生物活性，表达量可达400mg/L，分子量约为70kD，与理论值相似。此项研究虽然成功的表达了具有生物学活性的融合蛋白HSA-hPTH(1-34)，但是融合蛋白在毕赤酵母中表达后，其N端的PTH肽中氨基酸会被随机偶然修饰，影响了融合蛋白的质量，从而影响融合蛋白的实际应用，本发明利用酿酒酵母稳定完整的表达具有生物活性的融合蛋白HSA-hPTH(1-34)。 

发明内容

本发明的目的就是使融合蛋白能较完整的表达，提出一种构建重组人血清白蛋白-人甲状旁腺激素二联体融合蛋白酿酒酵母基因工程菌的方法。 

本发明的技术解决方案(以pYX212酿酒酵母表达载体为例描述) 

1.重组人血清白蛋白-人甲状旁腺激素二联体融合蛋白基因在大肠杆菌中的 构建及克隆： 

a.重组人血清白蛋白-人甲状旁腺激素二联体融合蛋白基因的构建：利用引物设计软件，根据已知序列设计并合成α-PTH(1-34)_ab-HSA引物，上游引物：ACCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATT；下游引物：ATCGTCGACTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG，实线处分别是BamH I和Sal I酶切位点，通过聚合酶链式反应合成α-PTH(1-34)_ab-HSA基因。 

b.通过聚合酶链式反应合成α-PTH(1-34)_ab-HSA基因，经BamH I和Sal I双酶切后与经过相同酶切的pYX212大片断连接，将连接后的质粒转化E.coliJM109进行pYX-α-PTH(1-34)_ab-HSA的克隆。 

2.将重组质粒pYX-α-PTH(1-34)_ab-HSA转化到酿酒酵母中表达，并进行鉴定。 

本发明采用大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达质粒pYX212，αFactor为分泌信号肽，在酿酒酵母中稳定完整的表达融合蛋白。所表达的融合蛋白PTH(1-34)_ab-HAS检测未发现N端的PTH肽中氨基酸被随机偶然修饰的现象。 

附图说明

图1为pYX212-α-PTH(1-34)_ab-HSA重组质粒构建示意图。 

图2为α-PTH(1-34)_ab-HSA克隆至pYX212酶切验证图谱 

其中，1：重组质粒pYX212-α-PTH(1-34)_ab-HSA双酶切BamH I/Sal I；2：pYX212双酶切BamH I/Sal I；M：λ-Hind III Marker/bp 

图3为酿酒酵母重组菌菌落PCR的验证图 

其中，M：λ-Hind III Marker/bp；1，2，3：α-PTH(1-34)_ab-HSAPCR扩增图谱；4：空白质粒pYX212菌株α-PTH(1-34)_ab-HSAPCR扩增图谱 

图4为重组酿酒酵母表达胞外蛋白验证图