[发明专利]高效RNA逆转录合成cDNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及RNA逆转录反应，尤其是涉及一种以RNA或mRNA为模板，高效RNA逆转录合成cDNA的方法。

背景技术

    在有互补的寡核苷酸引物的存在下，各种RNA依赖的DNA聚合酶可利用RNA作为模板，合成cDNA（Karkas，JD，PROC。NATL ACAD。美国70:3834-3838，1973），这种反应被称之为逆转录。通常来讲，使用逆转录酶，如来自鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV）的逆转录酶（鲍威尔，LM等，细胞50:831-840，1987），cDNA的合成率是比较低下的。使用耐热（大于50℃）的DNA依赖的DNA聚合酶，(Myers, T. W. and Gelfand, D. H. Biochemistry 30:7661-7666, 1991 和 U.S. Pat. Nos. 5,322,770; 5,310,652; and 5,407,800)  作为逆转录酶用于cDNA合成，可以提高cDNA的合成量，但仍不能达到令人满意的效果。而从微量RNA或mRNA含量的样本提取靶核酸，进行cDNA合成时，高产量的cDNA的合成对后续实验攸关重要，比如血清HCV RNA病毒检测。

美国专利777946和8071311公开了利用一种由5’ RNA部分和3'的DNA部分组成的复合引物进行常温DNA扩增方法。其中的复合引物在合成cDNA后，其5’RNA部分可被核糖核酸酶H酶（RNAH）降解掉，暴露出互补的3’单链末端，使后续的引物有机会结合在同一模板上，形成下一次扩增循环，使DNA扩增量提高。但是这种反应比较复杂，需要多种酶参与反应。因此，采用一种更简单的方法来增加cDNA的扩增量对于微量RNA模板的样品来讲尤其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效RNA逆转录合成cDNA的方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的高效RNA逆转录合成cDNA的方法，它是以正链RNA或mRNA为模板，使用逆转录引物，在逆转录酶的作用下进行cDNA的合成；其中：

所选逆转录模板的目标区段的3’端依次称为特异性引物结合区R1、间隔区S和部分模板片段区R2；

所用的逆转录复合序列引物由分别含有模板负链序列和正链序列的两段脱氧核苷酸片段组合而成：其中逆转录引物的3’端的P1区是一组和模板特异性引物结合区R1相互补的特异性脱氧核苷酸序列，逆转录引物的5’端的P2区是一组和部分模板片段区R2序列相同的特异性脱氧核苷酸序列。

所述和模板特异性引物结合区R1相互补的逆转录引物的3’端的P1区的脱氧核苷酸序列长度为15-24bp。

所述和部分模板片段区R2序列相同的逆转录引物的5’端的P2区的脱氧核苷酸序列长度为12-18 bp。

所述逆转录模板的特异性引物结合区R1、部分模板片段区R2之间的间隔区S的序列长度与逆转录引物P1区的序列长度相等或加/减1bp时，即S长度=P1长度或S长度=P1长度±1bp时，逆转录合成cDNA的合成量更高。

本发明的优点在于逆转录反应简单、高效，大大提高了cDNA的合成量，进而使后续PCR的扩增量大大提高。

本发明中的RNA或mRNA包括来自微生物（如病毒、细菌、衣原体和真菌等）、人和动植物等细胞。

本发明所述的逆转录初始反应中，逆转录引物的P1区段和模板RNA结合，在逆转录酶的作用下，合成和RNA互补的第一条cDNA链，由于逆转录引物的P2区含有可以和部分新合成的cDNA链互补的序列，在一定程度上可以随机在新的cDNA链的5’端形成一个发夹状结构，使得模板RNA上的引物P1区段所结合区域重新暴露出来，新的引物再结合其上，开设新一轮的cDNA合成。这样重复进行，形成一个在RNA模板上产生多个cDNA拷贝的逆转录反应。

附图说明

图1是本发明的反应模式图。

图2是实施例1的逆转录引物设计图。

图3是实施例1的实验结果图。

图4是实施例2的逆转录引物设计图。

图5是实施例2的实时荧光PCR检测HAV 及参照品反应图。

图6是实施例2的实时荧光PCR检测HAV参照品反应图。

图7是实施例2的逆转录引物设计对比实验结果图。

具体实施方式

本发明高效RNA逆转录合成cDNA的方法，它是以正链RNA或mRNA为模板，使用特殊设计的特异性逆转录引物，在逆转录酶的作用下进行cDNA的合成；其中