[发明专利]双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。

背景技术

生长激素受体  (growth hormone receptor，GHR)是生长激素(growth hormone，GH)的受体蛋白，由于生长激素为生物大分子，不能直接透过细胞膜，必须通过与位于靶细胞膜上的GHR结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能。生长激素受体是由单一基因编码的 ,含有 620 个氨基酸的单链跨膜糖蛋白 ,其胞外区 ,跨膜区及胞内区分别是由约246 ,24 ,350个氨基酸残基组成。它属于细胞因子P 造血因子受体超家族的成员之一 ,与其他受体具有相似的结构和功能 ,尤其胞外区约 200 个氨基酸具有较显著的同源性。

1987年 ,Lueng从兔肝脏中提取并纯化出 GHR ,又根据氨基酸序列首次从兔的肝脏 cDNA 文库中克隆出 GHR cDNA。随后人们相继克隆了人、 小鼠、 大鼠、 绵羊、 牛、 鸡等 20多种动物的 GHR cDNA，大多数哺乳动物的 GHR基因由 10 个外显子和9 个内含子组成。生长激素能促进人的生长，且能调节体内的物质代谢。它主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖，同时促进肝脏中的糖异生作用及对糖元进行分解，从而使血糖升高。还可促进脂肪分解，使血浆游离脂肪酸升高。饥饿时胰岛素分泌减少，生长激素分泌增高，于是血中葡萄糖利用减少及脂肪利用增高，此时血浆中葡萄糖及游离脂肪酸含量上升。由于生长激素必须通过与位于靶细胞膜上的GHR结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能，所以，组织中 GHR 含量多少 ,功能正常与否都影响 GH生理效应得以发挥 ,导致动物生长发育模式的变异。 

GHR在机体的生长和体内的物质代谢中有着关键的调控作用,双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。

发明内容

本发明提供了一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，GHR蛋白即生长激素受体  (growth hormone receptor，GHR)是生长激素(growth hormone，GH)的受体蛋白，克服了上述现有技术之不足，通过对GHR从基因、蛋白质、酶活性等多方面的研究, 必然会为糖尿病、部分肝病、肾功能不全、侏儒症、巨人症等疾病的预防和治疗带来新的希望。双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼GHR蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。本发明中的双峰驼GHR蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的GHR蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼GHR蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中33-1736位的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为1746bp，电泳结果见附图1， 其中33-35位为起始密码子ATG，1734-1736位为终止密码子TAG，33-1736位为编码蛋白质区域（CDS）。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。将双峰驼GHR蛋白基因cDNA序列中的编码序列（CDS）按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。

上述重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- 5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种双峰驼GHR蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：