[发明专利]一种鸭坦布苏病毒E蛋白基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于家禽基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白基因及其应用。

背景技术

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）是一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的新发病毒。该病死亡率在5%-10%之间，是自2010年起至今危害养鸭业最严重的疾病之一。根据国家水禽产业技术体系2010年11月份的调查，该病造成的经济损失已超过50亿。目前，没有有效的措施来预防该病的发生。因此，研制一种安全有效的“鸭坦布苏病毒病”疫苗对我国养鸭业的发展具有重要意义。

研究发现，鸭坦布苏病毒编码结构蛋白(C、PrM 和E) 和非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和NS5)。其中，E 蛋白在病毒受体结合、侵入和融合方面起到了关键的作用，是病毒的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原，也成为了宿主抗感染免疫的重要保护性抗原。通过基因工程制备的E 蛋白亚单位疫苗，成本较低且蛋白质量稳定，并且可以激发机体的免疫应答。因此，筛选当前鸭坦布苏病毒流行毒株的E蛋白基因进行疫苗研发，无疑具有重要的现实意义和市场开发价值。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白基因及其应用，即一种新的鸭坦布苏病毒E蛋白基因，及其作为疫苗的应用。

本发明一个方面提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明另一个方面涉及编码上述蛋白的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明再一个方面涉及鸭坦布苏病毒E蛋白在制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明获得的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种20日龄鸭坦布苏病毒阴性麻鸭，接种14日后取血测DTMUV抗体，免疫组DTMUV抗体全部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗可以引起麻鸭的免疫应答。

具体实施方式

本发明从DTMUV的病料中分离得到了新的鸭坦布苏病毒E基因，基因表达获得重组蛋白具有很好的抗原性，可以防御新型的鸭坦布苏病毒，从而促成了本发明。

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

一、鸭坦布苏病毒E基因的扩增

将临床分离的DTMUV的病料处理后接种SPF鸡胚盲传三代后，PCR扩增鸭坦布苏病毒E基因全长，引物序列如下：

E-F: 5′ AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA′3  （EcoR I）

E-R: 5′ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ′3   （Xho I）

PCR反应体系如下：5× PrimeSTARE^TM Buffer  10 μL；dNTP Mixture (2.5 mM)  4 μL ；PrimeSTARE^TMHS DNA Polymerase  0.5 μL；模板0.5 μL；引物1 μL/1 μL；ddH₂O  33 μL。

按以下参数在PCR仪上进行反应：98 ℃预变性30 s，然后以98 ℃ 10 s、 55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min进行25个循环。

扩增产物进行测序后将E蛋白基因序列（SEQ ID NO：2）在NCBI上Blast比对，同源性最高为97%，表明扩增的样品为新的病毒株。其翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

同时，对同一DTMUV的病料感染的不同SPF鸡胚，按照上述记载的条件进行扩增，扩增出的基因测序结果都一致，证明没有在扩增过程中产生碱基的错误。

将E蛋白基因的核苷酸（SEQ ID NO：2）5′端和3′端分别加上EcoR I和Xho I酶切位点，送基因公司进行全基因合成。

二、基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得

一、构建pET-28a(+)-E表达载体

1. PCR扩增E片段：

（1）设计引物