[发明专利]一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

    本发明主要涉及一种用于检测疫霉菌的通用分子引物、检测辣椒疫霉的特异性分子引物及其检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

辣椒疫霉能引起辣椒、南瓜、西葫芦等多种作物发病， 俗称“死秧病”，常引致辣椒等作物死苗、烂果，一般死株率为15％－30％，严重时高达60％以上，甚至毁种，严重影响辣椒等作物的产量与品质。该病于1918年在美国最早发现， Leonian于1922年分离并定名为Phytophthora capsici Leon。我国于60年代初始见于新疆，70年代偶尔发生，80年代中期以来连年发生，且很快由新疆经甘肃、青海等省迅速蔓延开来，现在陕西、江西、上海、湖南、安徽等全国大部分地区该病的危害都非常严重，特别是近年来，随着我国农业产业结构的调整，设施农业大量发展，辣椒种植面积不断扩大，该病在我国有逐年加重的趋势。这种严峻的形势要求尽快建立一套快速灵敏的检测方法用于辣椒疫病的早期诊断，为辣椒疫病的防治提供依据。

传统检测植物病害的方法为通过直接观察植物组织的发病症状，分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而直接观察会遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的爆发。辣椒疫霉菌引起的病害很容易与腐霉菌和镰刀菌引起的病害症状相混淆。因此对于辣椒疫霉诊断来说，分离得到病原菌的纯培养是必要的。而得到辣椒疫霉菌的纯培养后的鉴定工作依然困难重重，且辣椒疫霉与其他疫霉种之间形态差异较小，采用形态学为主要分类依据的传统鉴定方法很难对疫霉菌进行准确的鉴定，也难以快速及时地进行病害的诊断。费时费力，而且要求操作者具备丰富的疫霉菌分离、形态学鉴定知识，对基层植保工作者具有一定的难度。因此，开发出快速灵敏、易操作、易普及的检测方法对于控制由辣椒疫霉菌引起的病害具有十分重要的意义。

从聚合酶链式反应（PCR）发明以来，便以其快速灵敏的特性成为动植物病原物检测的重要方法。跟传统的检测方法相比较，PCR技术具有高度的特异性及灵敏度，且耗时短等优点，更可通过实时定量PCR技术对植物病毒、细菌、真菌及卵菌进行定量检测。发展分子检测方法的基础是寻找合适的病原菌分子靶标，目前广泛采用的植物疫病菌分子检测靶标是核糖体基因ITS序列，该序列在许多疫霉种间缺乏足够的多态性。此外，elicitin基因也被用来作为疫霉菌检测的标靶，Ras家族相关的编码基因Ypt1被广泛用于疫霉菌的分子检测，线粒体编码基因Cox1、Cox2和可能编码储存蛋白的Lpv基因分别作为橡树疫霉（P. ramorum）和樟疫霉（P. cinnamomi）检测的靶标。

本发明旨在寻找辣椒疫霉中新的分子检测靶标。Ykt6p是一个细胞存活必须的R-SNARE蛋白，Ykt6在真核生物的进化上非常保守，将不同物种中的Ykt6氨基酸序列进行比对分析，结果表明，在系统进化上疫霉和植物及藻类在亲缘关系上比真菌更近，这与疫霉的分类地位完全符合。由此我们将Ykt6作为一个新的分子检测靶标，通过序列比对分析设计出了一对疫霉潜在的通用分子检测引物，并在此基础上设计了辣椒疫霉特异性的分子检测引物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测疫霉菌的通用分子检测引物、检测辣椒疫霉的特异性分子检测引物及其检测试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测辣椒疫霉的分子引物及其检测试剂盒，所述的检测辣椒疫霉的特异性引物为：

上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC

下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT

所述的用于检测疫霉菌的通用引物为：

上游（21bp）PyktF：AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG

下游（21bp）PyktR：GTCTTGGACAACACGGCGGTG

所述的检测试剂盒为：

检测溶液Ⅰ包括： 25mmol Tris.Cl(PH 8.3)、125mmol KCl、3.75 mmol MgCl₂、0.25mmoldNTPs、疫霉属的通用引物PyktF/PyktR各 1μmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶50U，加入超纯水制备成1mL检测溶液。保存期限为1年。