[发明专利]一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，具体说是一种应用合成肽抗原包被ELISA板，并在此基础上制备的检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒。

背景技术

羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)引起可以感染山羊、绵羊及牛的导致山羊痘(variolacaprin，Goatpox)、绵羊痘(variolacaprin，Sheeppox)和牛的疙瘩皮肤病(Lumpy shindisease)的一种急性、热性、接触性传染病。主要表现为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，有较高的病死率，能造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易和养羊业的发展。其中羊痘在非洲，土耳其、印度、亚洲部分国家流行广泛，希腊也有零星分布。所以世界动物卫生组织(OIE) 将该病列为A 类疾病，我国将其列为一类动物疫病。此外，本病在公共卫生方面也有重要意义，中国、瑞典、印度依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道。世界各国都高度重视本病，有本病的国家和地区的易感动物及其有关的产品被世界各国列为严格限制进出口的对象。

目前该病缺乏有效的治疗药物，给该病的防控造成了很大的困难，因此羊痘的早期诊断就显得尤为重要。并且鉴于羊痘病毒对养羊业健康发展的巨大危害，开发一种操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好、方便基层应用并可产业化生产的血清抗体检测试剂是预防羊痘传播的可靠途径之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种以羊痘病毒合成肽抗原包被ELISA板为基础的检测羊痘病毒血清抗体试剂盒，此试剂盒可快速、特异、准确的检测羊痘病毒血清抗体，为羊痘病毒的临床诊断与预防提供参考依据，以克服现有检测方法存在的特异性不强，敏感性低等不足。

本发明的技术问题采用以下技术方案解决：

一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，包括以下步骤：

a.利用DNAstar(序列分析软件)软件设计针对羊痘病毒主要免疫蛋白P32的两条短肽片段；

b.将步骤a所设计序列采用常规合成肽方法合成肽段；

c.采用方正滴定方法，确定合成肽抗原包被ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay)板的浓度；

d.将阴性、阳性血清用PBS(Phosphate Buffer Solution,磷酸盐缓冲液)稀释为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160　5个稀释度，进行ELISA检测，取P/N(阳性/阳性)值最大，OD(optical delnsity,光密度)值接近1的血清最大稀释倍数为最适稀释度，确定阳性血清、阴性血清及待检血清稀释度和反应时间；

e.利用棋盘滴定法选择工作浓度，根据“阳性血清OD值接近1”和“阳性值/阴性值最大”的原则，确定酶标记抗体工作浓度及反应时间。

f. 采集未免疫过羊痘病毒疫苗的健康羊血清，测其OD值并除以标准阴性血清的OD值(S/N，样品/阴性), 将所得到比值的平均值加标准差作为判定阴/阳性的临界值。

所述肽段序列如下：

A：PELKSDNDIFYKKVDTVKDFKNSDVNFFLKDKKDDI

B: YKLEKELKLNRQVLNDSSKYILHNTKYLSKKRANEMKN。

所述步骤c确定合成肽最佳包被浓度为0.3ug/孔，其中A:B的比例为1:1(A为0.15ug/孔，B为0.15ug/孔)。

所述步骤d的标准阳性血清、标准阴性血清和待检血清样品稀释度的体积比均为1:20；标准阳性血清、标准阴性血清和待检血清最佳反应时间为45min。

所述步骤e酶标抗体工作浓度为：用PBS将兔抗羊IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白G)作1:400体积比稀释为酶标记抗体的最佳稀释度；酶标抗体最佳反应时间为45 min。

所述步骤f确定的判定标准为：S/N值≥2.20为阳性，S/N值≤1.65为阴性，S/N值介于2.20和1.65之间者为可以，应重测，重测后S/N≥2.20判为阳性，S/N值＜2.20判为阴性。

本发明的有益效果在于设计并合成了针对羊痘病毒P32蛋白的肽段，该合成肽的生物学活性接近于羊痘病毒天然蛋白，并且比天然蛋白更易操作，可替代羊痘病毒直接作为检测用抗原，在此基础上制备检测羊痘病毒血清抗体的ELISA方法，该方法具有快速、敏感、特异等特点，为大规模的羊痘流行病学调查提供可靠的技术支持。

具体实施方式