[发明专利]基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，涉及HBV细胞模型，具体涉及基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法，该细胞系可用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。

背景技术

研究显示，HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具，在研究发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中有重要的作用。HepG2.2.15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-1重组载体转染HepG2细胞,经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。目前Hep2.2.15仍是应用最为广泛的HBV细胞模型。近年来以拉米夫定为代表的核苷类似物类抗HBV药物的临床应用在为慢性乙型肝炎（CHB）患者带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题，目前临床上对于应用的核苷类（似）药物如拉米夫定、阿德福韦以及恩替卡韦均可检出相应的耐药病毒株。由于目前恩替卡韦为国内慢性乙肝患者的一线用药，虽然其高耐药屏障可以迅速抑制病毒并且耐药发生率明显低于拉米夫定以及阿德福韦，但是长期临床使用发现恩替卡韦耐药病毒株也在逐年增多，对于恩替卡韦耐药的患者可加用替诺福韦继续治疗，但国内并未上市以及其价格较为昂贵。一般临床上对于恩替卡韦耐药患者只能增加恩替卡韦剂量以联合阿德福韦继续治疗，因此，明显加重了患者的经济负担以及治疗顺应性。目前对于HBV耐恩替卡韦的分子生物学机制以及筛选新型药物的研究成为重点。目前已知耐核苷类药物HBV的基因变异主要集中于反转录区（RT区），临床最广泛的耐药恩替卡韦病毒株为在rtM204V即YVDD变异基础上再次发生T184、S202或M250的变异，可以导致HBV对于拉米夫定以及恩替卡韦的敏感性明显下降，由于RT区核苷酸变异影响耐核苷类药物HBV变异株的复制能力，耐药HBV病毒株的复制能力往往低于野生型约50-100倍左右，由HBV耐药变异株基因构建稳定表达HBV变异株细胞系的难度也相应增高。目前仅有少量文献报道耐拉米夫定和阿德福韦HBV细胞系的建立，但相应病毒产量以及病毒蛋白合成明显低于传统的HBV细胞系HepG2.2.15，并且没有稳定表达恩替卡韦耐药细胞系的建立报道。

在HBV耐恩替卡韦病毒株逐年上升的临床背景下，HepG2.2.15不能完全满足对于耐药HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，本发明拟在前期构建耐拉米夫定以及阿德福韦HBV细胞系的基础上，建立一种能够稳定表达HBV耐恩替卡韦变异株的肝癌细胞系。

发明内容

本发明的目的在于为满足对于耐药HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，提供基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法。

本实验室在前期构建野生型、耐拉米夫定以及阿德福韦变异型细胞系基础上进一步构建耐恩替卡韦HBV细胞株，该细胞株尤其适合实验室研究用。

本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD，（福建医科大学分子病毒实验室）其载体骨架为pREP10载体，该载体相对优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达；HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为恩替卡韦耐药基因型S202G后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-S202G；将该质粒转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与HepG2.2.15细胞株相比较后，确立耐药HBV细胞克隆株的建立。经检测，结果显示该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBVA181V能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可以产生感染性HBV颗粒，通过基因测序产生HBV基因序列与所转染质粒相同。与目前广泛使用的Hep2.2.15相比，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与略低于HepG2.2.15。

该细胞株命名为HepG2.HS202G，已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，中心保藏登记编号CGMCC No.6393。

本细胞株HepG2.HS202G通过下述方法构建，

1．质粒转染HepG2细胞