[发明专利]高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病虫防治技术领域，高效RNA干涉基因和杀线虫Bt基因聚合转化番茄，双重效果共同防治根结线虫。

背景技术

根结线虫病严重危害我国蔬菜、棉花、花生、烟草等多种经济作物和水稻、玉米等粮食作物的重要生物灾害，近年来农业种植结构与布局调整后问题进一步突出。目前对于作物线虫病害的防治主要依赖于杀线虫剂，由于杀线虫剂防治效果差导致农业减产，加之不合理使用带来了产品污染和生态环境破坏。因此，作物线虫病害的严重危害，直接威胁着我国的粮食安全和农产品安全。

利用植物介导的RNAi沉默线虫的关键基因成为潜在的最有价值的防治策略，可实现对植物线虫RNAi介导的分子调控（Urwin et al.,2002;Atkinson et al.,2003;Victoria et al.,2008）。根结线虫和胞囊线虫的生长和繁殖所需的营养物质是通过寄生在植物根部提供，利用植物表达线虫特异基因的dsRNA可实现对植物线虫的RNAi介导的分子调控。

从微生物资源中挖掘抗线虫基因是另一个重要的途径。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的内毒素是一种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、线虫等无脊椎动物具有活性的杀虫晶体蛋白(Crystal protein)，对人、畜和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不会造成环境污染。目前全世界共获得了70种转Bt基因的植物，种植面积达到26亿公顷（James,2005）。虽然在80年代初就有公司对Bt对线虫具有毒杀作用进行了专利保护。但是，人们对Bt杀线虫基因的研究却较少。2000年，加州大学Marroquin等(Marroquin et al.,2000)证实Bt杀虫晶体蛋白对线虫具有毒杀作用，具有杀线剂的潜力。将晶体蛋白喂食模式线虫发现线虫出现不育，死亡等症状。2003年，加州大学的Wei等（Wei et al.,2003）研究表明，Cry5Aa、Cry5B、Cry6B、Cry12A、Cry13A、and Cry14A、Cry21A蛋白对模式线虫均有毒杀作用。随后，Barrows等（Barrows et al.,2007）验证了Cry5B对模式线虫的作用。但是Bt杀虫晶体蛋白对植物寄生线虫的研究却没有进展。直到2007年和2008年，美国加州大学才将对模式线虫具有杀虫效果的Cry6A和Cry5B基因分别转化到番茄（Li et al.,2007;Li et al.,2008），接种南方根结线虫后发现，与对照相比，转基因番茄的根结数量和卵块数量均明显下降，说明Bt杀线虫基因具有巨大的应用潜力。目前，已发现cry5、cry6、cry12、cry13、cry14和cry21基因对线虫具有毒杀作用。苏云金芽胞杆菌的晶体毒蛋白具有广谱的毒杀线虫功能，其基因在转基因抗线虫育种中将具有广泛的利用前景，但仍需提高特异毒杀寄生线虫的活性。如通过转基因叠加多个抗线虫功能基因来转化培育作物广谱高效的抗线虫新品种。

利用转基因技术创造新的抗线虫植物品系对植物寄生线虫的防治，环境保护及农业可持续发展具有重要意义。但是，单一基因的转化，其防效有限。因此，采用转化作用不同的分子靶标基因有助于提高植物的抗性。由于RNA干涉和Bt对植物线虫的作用分子靶标不同，将这两种基因以不同的进行叠加转化与功能聚合，将可达到高效、广谱和持久抗线虫的效果。

发明内容

本发明根据上述领域存在的空白和根结线虫防治的需要，提供一种高效RNA干涉基因和杀线虫Bt基因共同作用的抗线虫方法及品种资源，本发明的技术方案如下：

一种高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以转入有RNA干扰载体pCAGC1341-TGPM01RNAi的转基因番茄为宿主植物转化外植体，

（2）构建含有外源基因的表达载体，所述外源基因指编码苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry6A晶体蛋白的基因，

（3）将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子。

所述构建好的重组表达载体指pBI121-06。

所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，其特征在于采用农杆菌介导的转化，所述农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，包括如下步骤：

（1）准备宿主植物转化外植体，

（2）制备根癌农杆菌转化液，

（3）根癌农杆菌转化液侵染外植体，然后共培养，