[发明专利]一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及香鱼假单胞菌的检测技术，具体涉及一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法。 

背景技术

香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）最初由患出血症香鱼内脏分离，近年发现在浙江、福建能引起大黄鱼内脏肉芽肿疾病。该致病菌可引起大黄鱼活动异常、内脏肉芽肿，组织坏死等症状。如2010年3月和11月宁波象山爆发了大规模的大黄鱼香鱼假单胞菌病，疫情涵盖各种规格大黄鱼，同时致病菌可通过亲鱼传递至下一代幼鱼中潜伏，大黄鱼的死亡率达60%以上，给当地养殖业带来巨大经济损失。因此预先分析、检测确定发病菌种就显得尤为重要。目前检测香鱼假单胞菌感染的方法主要包括：生理生化检测、组织病理学观察、显微镜检以及PCR等生物技术诊断方法。但是这些传统检测方法不能够区分香鱼假单胞菌与假单胞菌属中的其他细菌，如恶臭假单胞菌等，缺乏灵敏度和特异性。聚合酶链式反应（PCR）具有极高的灵敏度和特异性，已被广泛应用于致病菌的诊断实践，但其需要PCR仪等诸多精密仪器的配套使用，使其无法满足现场和基层检验的需要。为有效控制大黄鱼香鱼假单胞菌病，需建立灵敏、特异、高效和简便的检测技术。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒，该LAMP检测试剂盒具有高灵敏度、高特异性、适用于海水养殖场中大黄鱼香鱼假单胞菌病的现场快速检测；应用该LAMP检测试剂盒的检测大黄鱼细菌感染的方法具有操作简单，对仪器要求简单，结果易于观察等优点，为香鱼假单胞菌病的早期防治提供技术支持。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括10×ThermoPol 反应缓冲液、浓度为100mM的MgSO₄溶液、浓度为10 mM的dNTP液、浓度为5M的甜菜碱溶液、浓度为8 U /μL 的Bst DNA 聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / B3引物溶液和双蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列为：GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT， 所述BIP引物的核苷酸序列为：TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG， 所述FIP引物和所述BIP引物的浓度都为1.6～2.4μM，所述F3 / B3引物溶液含有F3引物和B3引物，所述F3引物的核苷酸序列为：TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述B3引物的核苷酸序列为：GCAGCTGCCCACTTGGT， 所述F3引物和B3引物的浓度都为0.4～0.6μM。 

所述的LAMP检测试剂盒的100×25μL反应体系配制方法如下：10×ThermoPol 反应缓冲液250μL、浓度为100mM的MgSO₄溶液50μL、浓度为10 mM的dNTP液300μL、浓度为8 U /μL 的Bst DNA 聚合酶液100μL、浓度为5M的Betaine溶液400μL、引物浓度都为1.6～2.4μM的FIP / BIP引物溶液50μL、浓度都为0.4～0.6μM的F3 / B3引物溶液50μL，余量用双蒸水补足。 

所述的ThermoPol 反应缓冲液的终浓度配制方法如下：200mMTris-Hcl，100 mM KCl，20 mM MgSO₄，100 mM (NH₄)₂SO₄，1.0％TritonX-100，pH8.8。 

所述的LAMP检测试剂盒还包括有阳性对照液和阴性对照液，所述的阳性对照液含有香鱼假单胞菌阳性DNA，所述的阴性对照液为双蒸水。 

一种利用鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒检测大黄鱼香鱼假单胞菌病的方法，包括下述步骤： 

（1）取被感染大黄鱼黄豆大小内脏组织一块，加入450??l的TE 缓冲液，同时用医用剪刀剪碎组织，室温6000r/min洗涤离心2min，倒掉上清液，取沉淀物再加入所述TE 缓冲液450μl，浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液3μl，质量百分浓度为20%的十二烷基硫酸钠溶液20μl，混匀，于37℃首次温浴30min，首次温浴结束，加入浓度为5mol/L 的NaCl溶液100μl，溴化十六烷三甲基铵氯化钠混合液80μl，混匀，于65℃再次温浴10min，得到菌体温浴液；