[发明专利]一种富集和无分化扩增贴壁干细胞的技术

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种富集和无分化扩增贴壁干细胞的技术。

背景技术

实体瘤是肿瘤疾病中的主要种类，是威胁人类健康的一种重要疾病。关于实体瘤的起源，目前存在着两种不同的模型。一种模型认为肿瘤是一种多基因功能异常的疾病。细胞/组织在病变过程中，随着致癌基因以及表观遗传基因突变的增加，细胞/组织逐渐形成癌前病变，癌变细胞/组织以及恶性癌变细胞/组织。另一类模型认为肿瘤是由肿瘤干细胞增殖分化出来的。肿瘤干细胞在肿瘤细胞/组织中的含量非常少，但却具有类似于胚胎干细胞的自我更新的能力。肿瘤干细胞是干细胞（胚胎干细胞以及成体干细胞）发生基因以及表观遗传基因突变后形成的具有恶性增殖特征的一类干细胞，是肿瘤细胞化、放疗失败的重要因素。肿瘤干细胞最初在白血病患者的肿瘤细胞中被分离出来，发现该肿瘤干细胞具有表面特征抗原CD96。随后在实体瘤中也发现并鉴定了肿瘤干细胞的存在。如在乳腺癌中存在着一种ABCG2基因高表达的细胞亚群，具有肿瘤干细胞的特征。另外还发现ALDH1,CD24,CD44,CD90,CD133也是用来鉴定肿瘤干细胞常用的一些生物标志物分子。肿瘤干细胞的分离主要是从新鲜的肿瘤组织中分离。分离方法主要是通过流式细胞分选技术以及免疫磁珠的方法进行。采用流式细胞分选方法获得的肿瘤干细胞纯度较高，可达95%以上，但分选过程会对细胞有较大的损伤，磁珠分选方法虽然条件比较温和，但是分选的干细胞纯度较低，达到80%就是一个比较好的分离结果了。上述两种方法面临的一个共同问题就是分离干细胞需要使用高质量的单克隆抗体，分离成本非常高。另外分离出的肿瘤干细胞如何扩增而不失去或改变其干细胞的特征仍然是一个当前没有解决的一个技术瓶径，是制约肿瘤干细胞研究和发展新的肿瘤治疗技术的技术障碍。

发明内容

本发明提出一种富集和无分化扩增贴壁干细胞的技术，解决了现有技术中分离干细胞需要使用高质量的单克隆抗体，分离成本非常高，分离出的肿瘤干细胞扩增却失去或改变其干细胞的特征的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种富集和无分化扩增贴壁干细胞的技术，在实体肿瘤细胞的培养中，以改性干细胞培养基进行肿瘤细胞的贴壁培养，肿瘤干细胞可以逐渐形成集落。

作为优选的技术方案，所述改性干细胞培养基按体积比包括70～100%的DMEM/F12和0～30%的RPMI-1640。

作为对上述技术方案的改进，所述改性干细胞培养基中还含有0～1μg/ml的EGF、0～1μg/ml的FGF-b、0～1μg/ml的IGF、0～1μg/ml的PDGF、0～1μg/ml的SCF、0～1μg/ml的TGF-β、0～1μg/ml的LIF、0～300nM的CHIR99021、0～1mM的PD173074、0～1mM的PD0325901和0～1mM的Y27632，能有效筛选肿瘤干细胞，通过抑制GSK信号通路和酪氨酸激酶抑制剂达到有效抑制干细胞分化，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。

作为另一优选的技术方案，所述改性干细胞培养基按体积比包括0～30%的DMEM基础培养基和70～100%的胚胎干细胞培养基HEScGRO。

作为对上述技术方案的改进，所述改性干细胞培养基中还含有0～1μg/ml的TGF-β、0～1μg/ml的SCF、0～1μg/ml的bFGF、0～1μg/ml的EGF、0～500nM的CHIR99021、0～1mM的PD173074、0～1mM的PD184352、0～1mM的PD0325901和0～100μM的Y27632，能有效筛选肿瘤干细胞，通过抑制GSK信号通路和酪氨酸激酶抑制剂达到有效抑制干细胞分化，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。

由于采用了上述技术方案，一种富集和无分化扩增贴壁干细胞的技术，在实体肿瘤细胞的培养中，以改性干细胞培养基进行肿瘤细胞的贴壁培养，肿瘤干细胞可以逐渐形成集落，该集落具有肿瘤干细胞的特征，，解决了现有技术中分离干细胞需要使用高质量的单克隆抗体，分离成本非常高，分离出的肿瘤干细胞扩增却失去或改变其干细胞的特征的问题。

下面结合具体实例进一步说明本发明：

实例1 人乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞的克隆培养与扩增