[发明专利]一种检测磷酸盐的微生物细胞传感器

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水体中磷酸盐含量的微生物细胞传感器的搭建及使用。

背景技术

随着社会经济不断发展和全球工业化程度的提高，全球许多河流遭受不同程度的污染，其中水体中磷酸盐含量过高导致水体富营养化是比较常见的污染现象。富营养化导致藻类和大型植物迅速生长，深水中溶解氧变少，透明度降低，最终导致水体中生态系统的恶化。因此对水体中的磷酸盐含量必须进行检测控制。利用微生物细胞传感器检测环境中特定物质含量是近年来兴起的一种新的检测方法。

发明内容

本发明检测磷酸盐的微生物细胞传感器是利用大肠杆菌中碱性磷酸酶基因启动子与商业化质粒中信号强度高的荧光素酶报告基因(luc)一起构建出的一种有效检测磷酸盐含量的微生物细胞传感器。

构建该细胞传感器的具体操作步骤为：

1、含有终止子的质粒的搭建：

对pUC19质粒用PstI与HindIII进行双酶切处理后纯化得到载体a；以大肠杆菌基因组为模板，扩增得到大肠杆菌终止子，用上述两种酶进行双酶切处理后纯化得到片段r；将片段r连入载体a，利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到含有终止子的质粒；

2、含有大肠杆菌碱性磷酸酶基因启动子的质粒的搭建：

对含有终止子的质粒用EcoRI与XmaI进行双酶切处理后纯化得到载体b；以大肠杆菌基因组为模板，扩增得到大肠杆菌碱性磷酸酶基因启动子，用上述两种酶进行双酶切处理后纯化得到片段n；将片段n连入载体b，利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到含有大肠杆菌碱性磷酸酶基因启动子的质粒；

3、目标质粒的搭建：

对含有大肠杆菌碱性磷酸酶基因启动子的质粒用PstI与XmaI进行双酶切处理后纯化得到载体c；以商业化质粒pEGMluc为模板，扩增得到荧光素酶报告基因，用上述酶进行双酶切处理后纯化得到片段u；将片段u连入载体c，利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到目标质粒；

4、得到检测磷酸盐的微生物细胞传感器：

利用商业化宿主感受态细胞为宿主，将目标质粒转入宿主细胞得到检测磷酸盐的微生物细胞传感器。

以下通过具体实事例详细说明发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：第一步：接种单菌落(载体细胞空白同时接种)于50ml三角瓶中；氨苄青霉素终浓度为100μg/ml；37度过夜培养；

第二步：5ml的LB培养基加入设定浓度的诱导物(如磷酸根标准溶液浓度100μM)；

第三步：菌体培养至OD600＝1.2；

第四步：稀释到OD600＝0.4，取5ml的稀释好的培养液加入第二步准备好的培养液中；23度诱导；

第五步：对于细菌，将40μl未转化细胞(载体细胞)与50μl转化的培养物混合(细胞浓度相同)加入10μl1M K₂HPO₄(pH7.8)，20mM EDTA(一个溶液)。用-70度冰箱快速冷冻混合物(冻融)(10min)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中(23度或置于室温下平衡30分钟)。加入300μl新鲜配制的裂解混合物(见附录)。混合并于室温孵育10分钟；

第五步：检测；每个96孔板中加入20μl的裂解液后，加入100μl荧光素酶检测液，立刻检测；

第六步：数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以400得到即为每毫升菌液对应的数值。

附录

10毫升裂解混合物配方：

5.5ml水

2ml5×CCLR

加入25mg BSA

2.5ml溶菌酶混合液(配5ml配方：0.5ml1M K₂HPO₄(pH7.8)，20mM EDTA+4.5ml无菌水然后加入25mg溶菌酶)混合均匀。