[发明专利]一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法

权利要求书

1.一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，其特征在于，通过肼氧化还原酶HZO基因的荧光定量PCR反应，对厌氧氨氧化细菌进行定量，步骤为：

（1）样品DNA的提取和定量

取沉积物样品，加入裂解液，在核酸提取仪中进行裂解，裂解后的样品冷冻离心取上清液，调整盐离子浓度后加入硅胶颗粒，使DNA结合在硅胶颗粒上，结合DNA的硅胶颗粒悬浮液转移入纯化柱，清洗去除蛋白质等杂质，最后用洗脱缓冲液洗脱结合在硅胶颗粒上的宏基因组DNA，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验DNA的浓度和纯度。用荧光定量仪测定宏基因组DNA浓度；

（2）HZO基因标准质粒的制作

使用HZO基因特异性引物hzoF1和hzoR1对样品DNA进行PCR扩增，

PCR反应体系为：10×PCR Buffer1.25μl，2.5mM dNTP 1.00μl，25mM MgCl₂0.75μl，10μg/μlBSA 1.00μl，20μM的hzoF1和hzoR1引物各0.25μl，沉积物总DNA 1.00μl，TaqDNA聚合酶2.5U，双蒸水补足到25μl，

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，

合并多次反应得到的PCR产物，切胶回收后连接入pGMT-19Simple Vector载体中，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，液体LB培养基过夜培养，提取质粒，测定浓度后将质粒10倍浓度梯度稀释，制作标准品，用荧光定量仪测定质粒浓度，计算基因拷贝数；

（3）荧光定量PCR扩增

调整所有样品DNA的浓度至10μg/μl，对标准质粒和样品在同一批次进行荧光定量PCR扩增。

反应体系包括：2×SYBR Green Premix 7.5μl，10μM上下游引物各0.3μl，50×ROXReference Dye II 0.3μl，模板DNA1.0μl，双蒸水补足到总体积12.5μl，

PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，80℃延伸40s，循环40次，80℃读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性；

（4）沉积物样品厌氧氨氧化细菌数量计算

根据标准质粒的初始拷贝数的对数值和Ct值制作标准曲线，得到回归曲线和公式，根据定量PCR反应得到的样品Ct值，计算出HZO基因的拷贝数。