[发明专利]一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法

权利要求书

1.一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的方法包含：

步骤1，进行目标细胞的培养和铺板；

步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤1所述的细胞进行共转染；

步骤3，进行荧光素酶活性检测；该步骤三包含：

将步骤2所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3′UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取15-20 μl细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。

2.如权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的工作液通过Kenreal试剂盒配置；

所述的工作液包含用于测定萤火虫荧光素酶活性的工作液1和用于测定海肾荧光素酶活性的工作液2。

3.如权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，步骤3所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。

4.如权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，步骤3所述的含有VEGFA基因3′UTR与报告基因的重组质粒，其制备方法包含：

步骤3.1，对载体质粒进行扩增和抽提；

步骤3.2，对VEGFA基因的3′ UTR序列进行克隆、酶切及纯化；

步骤3.3，进行所述的VEGFA基因的3′ UTR序列与所述的载体质粒的连接；

步骤3.4，筛选重组子。

5.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3.1包含：

用所述的载体质粒转化大肠杆菌感受态细胞，进行扩增；然后采用碱裂解法抽提制备所述的载体质粒，电泳检测所述载体质粒的纯度和含量；再用NcoI和HindIII对所述载体质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。

6.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3.2包含：

步骤3.2.1，根据人的VEGFA基因的3′ UTR区序列设计两端引物：

引物1为上游5′端引物，其中包含19个VEGFA基因的3′ UTR互补碱基，一个HindIII识别位点，3个保护碱基；

引物2为下游3′端引物，其中包含19个VEGFA基因3′ UTR互补碱基，一个NcoI识别位点，4个保护碱基；

步骤3.2.2，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增；

步骤3.2.3，反应结束后，取5μl反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤3.2.4，取反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收；

步骤3.2.5，将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切，再次回收以备连接使用。

7.如权利要求6所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的PCR反应的反应条件为：在95℃变性3min，再在95℃循环30s，然后在55℃退火45s，再在72℃延伸1min，进行40个循环，最后在72℃最终延伸8min。

8.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3.3的连接采用DNA连接试剂盒，进行连接反应。

9.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3.4包含：

取连接产物直接转化感受态大肠杆菌；经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养；从培养平板上随机挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用；最后经过酶切、PCR、测序鉴定。