[发明专利]检测莱克多巴胺的化学发光免疫检测试剂盒

说明书

本申请是中国发明专利申请“检测莱克多巴胺的化学发光免疫检测试剂盒”的分案申请，申请号为200810203435.0，申请日为2008年11月27日。

技术领域

本发明涉及一种检测莱克多巴胺的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物源性食品中如动物组织、内脏、血液、尿液和饲料、饲料原料中的莱克多巴胺含量或残留量。属于免疫学检测领域。

背景技术

莱克多巴胺(Ractopamin)属于β-兴奋剂。β-兴奋剂是营养重分配剂的一种，是一类结构和功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，它能改善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率，并能加速动物生长，而被添加于动物饲料中。常见的β2-兴奋剂有克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇等。随着我国对克伦特罗(俗称″瘦肉精″)监管力度的加大，克伦特罗的使用逐渐减少，其他β2-兴奋剂的使用逐渐增加。由于莱克多巴胺有类似于克伦特罗的作用，在动物组织中残留，从而对人体产生不利影响，所以我国禁止莱克多巴胺其作为饲料添加剂使用。

在莱克多巴胺的检测方法方面，目前最为常用的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳、酶联免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等方法。

1、高效液相色谱(HPLC)用于莱克多巴胺的检测：

HPLC法具有检测精确度高、假阳性率低的特点。HPLC法的主要缺点是仪器价格昂贵、操作比较繁琐，耗时长，检测费用昂贵；且前期样品的萃取条件的选择也对检测灵敏度和准确性有较大影响。

2、气相色谱-质谱联用(GC-MS)用于莱克多巴胺的检测：

GC-MS灵敏度很高，假阳性率低。该方法的主要缺点是样品需要衍生化这样复杂的前期处理。虽然经过衍生化处理的样品能在质谱中给出更多的结构信息，但是衍生化会产生多个不同的产物并导致样品的部分丢失，造成实验结果的偏差。

3、液相色谱-质谱联用(LC-MS)用于莱克多巴胺的检测：

LC-MS对样品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测。LC如果与两个串联MS联用，可进一步提高信噪比。LC-MS的缺点与GC-MS一样，操作步骤繁琐，需要贵重仪器，所以一般用作对阳性结果的确认手段。

4、毛细管电泳用于莱克多巴胺的检测：

毛细管区带电泳法分离效率可达几百万理论塔板数，操作快速简便，所需样品量少。但是该方法所需仪器昂贵，且可检测出莱克多巴胺的最低残留量达不到其它方法的灵敏度。

5、酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于莱克多巴胺的检测：

酶联免疫吸附分析法是当前应用最广、发展最快的免疫酶技术之一，主要优点在于检测迅速，样品前处理简单，检测系统操作简单，成本低，同时便于进行大规模检测。其基本原理是，将抗原(或抗体)吸附在固相载体上，酶标记抗体(或抗原)与相应的抗原(或抗体)反应，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应底物时，可以催化底物水解、氧化或还原并产生有色物质，颜色的深浅与相应的抗体(或抗原)量成正比，故可以借助成色反应的程度来定性或定量抗体(或抗原)。ELISA检测方法主要包括双抗体夹心法、间接法、竞争法等。双抗体夹心法主要适用于分子量较大的完全抗原，而竞争法则适用于抗原决定位点较少的小分子量半抗原。由于莱克多巴胺是小分子化合物(相对分子质量小于5000)，属于半抗原，因此常用竞争酶联免疫吸附法来测定。

6、化学发光免疫检测技术的工作原理与特点

化学发光免疫检测技术不同于酶联免疫吸附分析法，它是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。

化学发光免疫分析法的基本原理与ELISA相似，不同之处在于酶标记物的反应体系是化学发光反应。HRP(辣根过氧化物酶)和鲁米诺或其衍生物体系就是常用的反应体系之一，在该发光体系中加入增强剂可增加化学发光强度，并在较长时间保持稳定，从而大大提高免疫分析的灵敏度。如我国胥传来等(胥传来等，分析化学研究简报，2005，33(5)：699-702)建立的间接竞争化学发光免疫法检测猪尿样中克伦特罗，实际检测范围为0.04～25.8μg/kg。胥传来等人所用方法的缺点是需要同时使用一抗和二抗(其中二抗为酶标记抗体)，两种抗体加入后都需要进行温育反应，延长了检测时间。

发明内容