[发明专利]一种有机磷农药降解酶突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种有机磷农药降解酶突变体及其制备方法。

背景技术

有机磷农药（organophosphorus pesticides，OPs）是农业生产中使用最为广泛的一大类农药(Singh BK.2009.Organophosphorus-degrading bacteria:ecology and industrial applications.Nature Reviews Microbiology.7:156-164)。自1944年德国拜耳公司首先发现有机磷具有杀虫特性并制造出第一种杀虫剂“l605-对硫磷”以来，有机磷作为一类高效、广谱的杀虫剂被广泛应用，在很大程度上提高了农作物的产量。据统计,2010年我国农药的总产量超过200万吨（中华人民共和国国家统计局中国统计年鉴-2010。北京:中国统计出版社,2011:14-221），其中有机磷农药产品占到其总量的80%。目前市场上有机磷农药商品的种类达上百种之多,我国所广泛使用的,包括毒死蜱、丙溴磷、乙酰甲胺磷、二嗪农和敌敌畏等杀虫剂(巨修练,李常平2010。有机磷杀虫剂的选择性与安全性。农药科学与管理。31:19-211),稻瘟净、克瘟净等杀菌剂的种类就达到30多种。此外,在我国经常使用的其他有机磷产品还有有机磷灭鼠剂、有机磷除草剂、生长调节剂等(张婵,廖晓兰2010。有机磷农药的微生物降解技术研究进展。广西农业科学。41:1079-10821)。大部分有机磷农药不溶于水(乐果、敌百虫除外)，而易溶于有机溶剂，在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下因水解而失效。

有机磷农药属有机氯农药的取代物，具有药效高,品种多,防治范围广,成本低,比有机氯农药容易降解,对环境的污染及对生态系统的危害和残留均未有机氯农药普遍和突出等优点，为增加粮食生产、防治疾病传播作出了巨大贡献。但是,随着农业的发展,有机磷农药的使用量越来越大,大量有机磷农药残存于水和土壤中,不仅对地表农药残留量超标,造成食品污染，而且通过各种途径和地下水资源造成污染。

有机磷农药是一种神经性毒物,在人体内长期蓄积滞留会引发慢性中毒,导致人体神经功能紊乱,发生出汗,迟钝,神经失常和语言失常等症状。含有有机磷的农药通过食物残留等方式进入食物链，并在生物体中进行生物富积，从而造成致畸、致癌、致突变等危害，最终威胁到人类的生存与社会的可持续发展。因此,在日益重视环境保护能力的趋势下,加强有机磷农药降解方法的研究,解决有机磷农药对环境及食物的污染问题,是人类当前迫切需要解决的问题之一。

有机磷农药污染降解技术可分为热降解、光降解、化学降解和生物降解。生物降解是通过生物的作用将农药分解为无毒或低毒小分子化合物，并最终降解为水、CO2和矿物质的过程。相对于物理、化学降解技术，生物降解具有高效、彻底、无二次污染的优势。作物本身、微生物都能够降解有机磷农药残留，但植物的降解很缓慢，周期很长，微生物由于其强大的代谢多样性，在有机磷农药残留降解中具有更大的优势。现今,用微生物或微生物源酶制剂降解残留农药越来越受到重视,对微生物降解有机磷农药的研究已成为环保的一大重要课题。

有机磷农药降解酶微生物对于农药的降解可分为酶促和非酶促反应。所谓酶促反应是指微生物以胞内酶或分泌的胞外酶直接作用于农药，经过一系列生理生化反应，最终将农药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程。而非酶促形式指的是微生物通过代谢改变农药的环境离子浓度、pH等物理、化学性质，从而间接促使降解农药的过程。酶促反应是微生物降解农药的主要形式。当有机磷农药进入土壤后,微生物马上能产生降解有机磷农药的降解酶;另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系,当农药进入环境后,由于微生物生存的需要,微生物在适应环境的过程中基因发生重组或突变,产生新的降解酶系。

有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法。常见的有机磷农药降解酶主要是水解酶类，包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等，它们主要通过裂解P-O，P-S，P-N等键，使有机磷农药被降解，生成简单无机化合物。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药（Theriot CM,Grunden AM.2011.Hydrolysis of organophosphorus compounds by microbialenzymes.Appl Microbiol Biotechnol.89,35-43）。