[发明专利]一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于通过组织培养获得再生苗的方法，特别涉及一种通过珙桐组织（叶片）培养获得珙桐再生苗的方法。

背景技术

珙桐(Davidia involucrata Baillon)亦称为水梨子或鸽子树，为珙桐科(Davidiaceae)珙桐属(Davidia)植物，是我国特有的单型属珍稀树种，作为第三纪古热带植物区系的孑遗种，被列为国家一级重点保护植物，需要加强保护。珙桐树高10~20米，开花时，其棕红色头状花序和基部两片苞叶的结构形似白鸽，远看就像一群白鸽栖息在绿荫丛中，因而也具有很高的观赏价值。

珙桐用种子繁殖较为不易，往往发芽率低、发芽时间长，故目前多采用无性繁殖。珙桐栽培中常用的无性繁殖方式包括扦插繁殖、嫁接繁殖、埋条繁殖和高压繁殖等。但这些繁殖方式繁殖系数低、速度较慢，且成活率不高，所以现在城市绿化中还见不到珙桐的身影。针对这一现状，采用组织培养方法来繁殖珙桐被越来越多的人所尝试，目前关于珙桐组织培养的报道主要集中在对愈伤组织的诱导与培养上，关于再生体系的研究较少。在仅有的再生体系研究中，又多以珙桐冬芽或带芽茎段做为外植体，在操作时需要采集在珙桐生长过程中非常重要的芽或茎，这会造成对珙桐这一濒危植物的破坏。而现在以珙桐叶片为外植体的再生体系效率极低，仅有的成功报道其愈伤组织分化率仅为6%，这并不能满足实际运用中的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法，以提高珙桐叶片愈伤组织再生途径的效率，获得移栽成活率高的再生苗。

本发明所述以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法，步骤如下：

（1）珙桐叶片愈伤组织获得

取灭菌后的幼嫩珙桐叶片，接种于愈伤组织诱导培养基上，避光培养25~30天，得到珙桐叶片愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织诱导培养基中含有吲哚丁酸1.5~2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.5mg、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；

（2）愈伤组织增殖

将步骤（1）获得的珙桐叶片愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基上，避光培养18~28天，以使愈伤组织增大，所述愈伤组织增殖培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织增殖培养基中含有吲哚丁酸1.5~2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1~2.5mg 、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；

（3）诱导丛生芽

将步骤（2）增殖后的珙桐叶片愈伤组织切割后接种于芽分化培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间10~14h/d的光照条件下培养25~30天，以诱导丛生芽，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，每升芽分化培养基中含有吲哚丁酸 0.33~1mg、6-苄氨基腺嘌呤 3~10mg、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；

（4）丛生芽增殖

把步骤（3）获得的丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间10~14h/d的光照条件下培养25~30天，以使丛生芽生长，所述芽增殖培养基以MS为基础培养基，每升芽增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.1~0.5mg、赤霉素0.1~0.5mg、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；

（5）诱导生根

从步骤（4）增殖后的丛生芽上切下幼芽，接种于第一生根培养基中培养3~6天，再转接到第二生根培养基中培养，在第二生根培养基中的培养时间以达到幼苗移栽要求为限（时间约25~30天），用上述两种生根培养基培养时的光照条件为：光照强度为1500~2000lx、光照时间10~14h/d，所述第一生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第一生根培养基中含有生长素5~15mg、蔗糖15~20g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1，所述第二生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第二生根培养基中含有活性炭1~2g、蔗糖15~20g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1。

上述方法中，步骤（1）至步骤（5）中的环境温度优选22~26℃。

上述方法中，步骤（1）至步骤（5）中的环境湿度优选60%~90%。

上述方法中，第一生根培养基中的生长素为吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸中的任一种。