[发明专利]卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种卤醇脱卤酶、编码基因及载体，产卤醇脱卤酶的新菌株，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

（二）背景技术

卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解有机卤化合物的关键酶之一。根据其序列同源性分为HheA、HheB、HheC 3类。有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一，主要是由于排废以及人工合成卤化物的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物和脱卤酶降解有机卤化物已引起人们广泛的关注，在环境污染治理，特别是手性环氧化物合成方面等具有十分重要的作用。

卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低络氨酸的pKa值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应，可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N₃^-、NO₂^-、CN^-等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的β-取代醇。因此可以用来合成一些非自然手性化合物。

卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及β-取代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。

近年，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，如Agrobacterium radiobacter AD1，Agrobacter sp. AD2，Corynebacterium sp. N-1074，Agrobacterium tumefaciens，Arthrobacter erithii H10a，Alcaligenes sp. DS-K-S38 ，Pseudomonas sp. DS-k-2DI 等。部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化形成环氧化合物及β-取代醇。但是对已有卤醇脱卤酶进行研究的同时，挖掘新的的微生物来源的卤醇脱卤酶基因仍是今后研究的热点。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种源自壤霉菌（Agromyces sp.）的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及编码所述卤醇脱卤酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO：1所示。

该卤醇脱卤酶基因由如下方法得到：利用硫酸铵沉淀和离子交换等分离纯化手段从壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC NO：M 2012299菌株中分离纯化得到脱卤酶蛋白，经过N端序列测序和肽指纹图谱分析，发现该酶与Arthrobacter sp. AD2 和 Corynebacterium sp. N-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA存在同源性，以此设计引物。利用PCR技术，在引物1（ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC）、引物2（TTAGGGCAGATAGCC ACCG）的作用下以来源于壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC NO：M 2012299菌株中的总基因组DNA为模板克隆长约0.75kb的卤醇脱卤酶基因片段。将该片段连接到pMD18-T载体上获得克隆载体pMD18-T-Deh和转化了pMD18-T-Deh的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为735bp的开放阅读框。该基因核苷酸序列为（SEQ ID NO.1）：

1      ATGCGCATCG CCCTCGTGAC TCATGCACGG CATTTTGCAG GCCCCGCCGC CGTCGAGGCG

61     CTTACGCGGG ATGGCTATAC CGTGGTTTGC CACGACGCGA GCTTCGCTGA TGCAGCTGAA