[发明专利]一种以葡萄糖为底物合成生松素的大肠杆菌工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生松素的大肠杆菌工程菌，是一种通过合成生物学和代谢工程手段过量表达由aroF、pheA^fbr、PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC等八个基因组成的合成途径，实现以葡萄糖为底物来生产生松素的大肠杆菌工程菌。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物，其羟基衍生物多具黄色，因而得名。黄酮类化合物具有多种生物活性，主要包括心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎等，对镇痛、保肝、抗突变、降血糖和止咳平喘等具有预防、治疗或辅助治疗效果，而且人体不能合成黄酮类化合物，只能从植物性食物中获得，因此近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30％以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。

黄酮类化合物分布广泛，种类繁多，黄酮类化合物主要包括黄酮类(如黄岑素、黄岑苷等)、黄酮醇类(如槲皮素、生松素等)、二氢黄酮类(如陈皮素、甘草苷等)、二氢黄酮醇类(如水飞蓟素、异水飞蓟素等)、异黄酮类(如大豆素、葛根素等)、二氢异黄酮类(如鱼藤酮等)、查尔酮类(如异甘草素、补骨脂乙素等)、橙酮类(如金鱼草素等)、黄烷类(如儿茶素等)、花色素类(如飞燕草素、矢车菊素等)和双黄酮类(如银杏素、异银杏素等)。而其中生松素是一种很重要的黄酮骨架物质，人们可以通过对生松素进行羟基化、还原化、烷基化、氧化等修饰而获得良姜素、黄烷酮醇、白杨黄素等众多黄酮物质，另外生松素本身作为一种黄酮物质具有多种生物活性，主要包括缓解神经痛，防止脑水肿的发生，减少脑缺血的发生几率等。

目前，工业上生产生松素主要采用植物提取和化学合成等方法，但是如何从植物复杂的提取液中得到所需要的高纯度黄酮仍然是人类无法解决的一个技术难题，而高污染、使用有毒和有害化学试剂、以及黄酮物质的复杂结构等因素限制了化学法的使用，正因如此，微生物发酵法以使用廉价无污染的原料、较低的污染的排放、较低的能源需求等优点受到越来越多的关注。目前国内外关于微生物发酵法生产生松素的研究都需要在发酵液添加价格昂贵的前体物质如苯丙氨酸或者肉桂酸，而且从食品安全角度来考虑，由于肉桂酸是从脱胎于石油工业的化学合成法合成而来，因此肉桂酸的添加尤其得不到商业上的应用。另外目前的发酵法都采用的是两步法生产，即菌株首先在营养丰富的培养基中生长，在达到一定菌浓的时候，通过离心等方法收集所有的菌体置于基本培养基中发酵，显然这种发酵方式无法应用于大规模工业化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以葡萄糖为底物直接合成生松素的基因工程菌株，无需添加贵重的前体物质，只在单一培养基中便能合成生松素的大肠杆菌工程菌，通过在菌株体内构建从葡萄糖到生松素的由aroF、pheA^fbr、PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC等八基因构成的合成途径，实现以葡萄糖为底物来合成黄酮骨架物质生松素。

以下是本发明技术方案的详细描述。

途径基因的选择

以葡萄糖为底物的L-Phe生物合成途径由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(E4P)在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases，DS)的催化下缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反应为第一个限速反应。第二和第三个限速反应分别为由分支酸在分支酸变位酶(Chorismate mutase，CM)的作用下转变为预苯酸，继而在预苯酸脱水酶(Prephenate dehydratase，PDT)的作用下脱水、脱羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因编码的双功能酶。因此过量表达pheA和aroF这两个基因。