[发明专利]一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断和鉴定技术领域，具体涉及以BmCPV RDRP基因为靶标的一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物及快速检测方法。

背景技术

家蚕质型多角体病又称家蚕中肠型脓病。病原为家蚕质型多角体病毒(Bombyx moriCytoplasmic polyhedrosis virus。简称BmCPV)，是呼肠弧病毒科质型多角体病毒属的模式种。家蚕质型多角体病是家蚕第二大病毒病，在生产上危害严重。该病是一种慢性病，病原是一种具包涵体的多角体病毒，核酸类型是dsRNA，具有独立的十个片段组成。病毒通过家蚕食下感染，侵染中肠圆筒状细胞，在细胞质中形成多角体，导致细胞破裂，病毒多角体通过粪便排出体外，感染其它健康个体，形成严重的蚕座传染，蚕儿感染病毒后，正常消化功能受到影响，相继发病死亡，蚕茧减产甚至绝收，对蚕桑生产造成巨大的威胁。目前对BmCPV还没有特效型的蚕药，生产上主要通过加强养蚕前消毒，蚕期蚕座消毒，养蚕结束后的回山消毒等预防措施。对于发病个体，只能淘汰处理，无其它有效手段。

RDRP基因是BmCPV第二分节片段，依靠宿主翻译系统，能翻译成RDRP酶，RDRP酶在RNA病毒转录、复制过程中起到非常重要的作用，它一方面以病毒RNA为模版复制子代病毒的基因，另一方面将病毒增殖过程中需要的蛋白质和酶类基因转录为mRNA，即具有复制酶和转录酶的双重功能，人类一些病毒病的分子治疗研究，例如SARS病毒，肝炎病毒等RNA病毒，分子治疗靶标均为RDRP基因。

目前，根据其核酸数量和多角体形状及在细胞内形成的部位，将BmCPV分为9个株系，其中BmCPV-1株的RNA基因全序列已被测定，松毛虫及马尾松毛虫CPV全基因序列也被测定，但对其分子生物学检测方法报道较少。刘吉平（2011年专利）报道了利用BmCPV第五基因片段做检测靶基因，能够快速检测BmCPV，吴萍（2012年专利）公开利用BmCPV第五基因片段采用荧光定量PCR检测BmCPV。本发明的检测靶基因是第二片段RDRP基因，提供一种可行的检测内容和检测方法。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是以BmCPV的RDRP基因为检测靶标，提供检测引物和检测工艺应用于检测家蚕质型多角体病毒。

技术方案：一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

一种应用于检测家蚕质型多角体病毒的试剂盒，含有权利要求1所述的引物。

一种利用权利要求1所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，包括以下步骤：

（1）试剂盒抽提家蚕质型多角体病毒RNA；

（2）试剂盒对所提RNA采用Random Primer引物进行反转录；

（3）应用所述引物对反转录样本进行PCR扩增；

（4）取步骤（3）PCR扩增产物用1％的琼脂糖电泳检测。

具体步骤为：

1)病毒多角体悬浊液200μL，转入1.5mL离心管，加入400μL裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混匀；

2）室温放置10min，每隔5min，振荡混匀一次；

3）加入450μL无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；

4）将上述混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液；

5）加500μL去蛋白液RE，12000rpm离心30s，弃废液；

6）加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃废液，重复一遍；

7）将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液RW；

8）取出吸附柱RA，放入一个RNase free的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μL65-70℃RNase free H₂O，室温放置1min，12000rpm离心1min；

9）同步骤1～8抽提家蚕中肠总RNA；

10）反转录合成第一链cDNA：100ng/μL Total RNA，1μL；0.1μg/μL Random Primer，1μL；10mM dNTP Mixture，1μL；5×RT Buffer，4μL；40units/ul Rnase Inhibitor，0.5μL；TUREscript H-Rtase，1μL；RNase free H₂O，11.5μL；混匀25℃孵育10min，42℃孵育50min；然后70℃孵育5min。