[发明专利]一种GAP基因启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种GAP基因启动子，特别是一种来源于产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)的启动子。

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis，CCTCC：M93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日，具有耐高渗、高产量，高转化率，生产强度大的特点，居世界领先地位。它能在25％葡萄糖或5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，在实验室规模发酵中，甘油产量可达到12％，即使在工业化规模中，甘油产量也可达10％，这是用酿酒酵母甘油代谢理论难以解释的。

基因表达的最终产物是RNA和蛋白质，任何基因表达调控程序上的缺陷或紊乱，均会对生物体造成严重后果。因此，基因表达调控的机理研究是分子生物学研究的热点和前沿。编码蛋白质基因的表达需要转录和翻译两个环节，每个环节都存在着不同的基因表达调控位点。而启动子的调控在转录环节又占有十分重要的地位。因此，研究启动子的功能对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。强启动子对于高效基因表达是必需的。

启动子区对驱动和调节基因表达而言是必需的。这些DNA序列的延伸通常发现在基因开放阅读框架的上游。启动子中的关键遗传元件包含增强子位点、沉默子位点、上游活化子序列、转录因子结合位点和RNA聚合酶结合位点。这些元件对指定生物体的外部环境作出应答从而根据生长条件调节基因表达。获得高效启动子具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的产甘油假丝酵母基因及其启动子序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的多核苷酸序列SEQ ID NO.1，来源于产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因表达框。

包含所述启动子的载体，例如表达载体、克隆载体及穿梭载体均为本专利的保护范围。

本发明提供的载体可应用于酵母表达系统；功能基因的筛选(基因克隆于启动子后)、鉴定及优化；调控基因的表达；功能基因的稳定表达(基因克隆于启动子后)或过表达(采用多个启动子或启动胁迫机制)。上述关于启动子的常规应用均属于本发明的保护范围。

产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度的验证：

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度的的重组表达载体(图1)，构建过程如下：

(1)PCR克隆或采用化学全合成的方法将产甘油假丝酵母CgGAP基因启动子P_CgGAP连到质粒载体PYX212(Regenberg，B.，L.During-Olsen，M.C.Kielland-Brandt and S.Holmberg，(1999)

Substrate specificity and gene expression of the amino-acid permeases in Saccharomyces cerevisiae.Curr.Genet.36：317-328.)上，得到载体PYX212-P_CgGAP；

(2)将绿色荧光蛋白基因GFP，连接到载体PYX212-P_CgGAP上，得到载体PYX212-P_CgGAP-GFP；

(3)将zeocin抗性基因连接到载体PYX212-P_CgGAP-GFP上，得到载体PYX212-zeocin-P_CgGAP-GFP；

通过构建的重组表达载体PYX212-zeocin-P_CgGAP-GFP，重组质粒用热击方法转化酿酒酵母(ATCC：4098^TM)，涂布含有zeocin的YEPD抗性平板。从YEPD抗性平板上挑取单菌落，转接添加zeocin(150ug/mL)的YEPD液体培养基，提取质粒，验证阳性转化子。

从平板上挑取阳性克隆，接种于10mL含有150ug/mL zeocin的YEPD液体培养基中。30℃培养20h，离心收集菌体，转接入10mL的YEPD液体培养基中。30℃培养24h，摇床转数200r/min。

利用Olympus荧光显微镜进行荧光分析。以绿色荧光蛋白为标记证实了构建的整合表达载体的实用性及可行性，进一步验证了产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度。