[发明专利]游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷的制备方法。 

背景技术

α-熊果苷具有显著抑制酪氨酸酶的活性，可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效。在比较α-熊果苷与其同分异构体β-熊果苷的美白效果时，Kazuhisa等学者发现α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上，且对人体具有很好的安全。目前，α-熊果苷是国际公认的并正在极力推广的高效、安全的美白剂，是美白、祛斑、防晒化妆品理想的添加成份。 

作为α-熊果苷合成反应物之一的对苯二酚具有杀菌作用，它可以通过降低细胞内巯基水平及升高活性氧水平改变细胞内氧化还原状态而引起细胞凋亡。当α-熊果苷合成反应体系中游离对苯二酚的浓度超过一定量时,会对菌体产生毒害作用，导致菌体催化能力显著下降，不利于α-熊果苷的合成。因此，研究一种既可以提高反应体系中对苯二酚的浓度又可以降低其毒害作用的方法，成为大规模低成本生产α-熊果苷的必然选择。 

固定化(immobilized)技术是用化学或物理手段将物体定位于限定空间区域的一门新兴技术，在化工、发酵、能源、医药等行业应用广泛。大孔吸附树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附树脂，有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。 

目前，由于利用化学合成方法很难合成α-熊果苷，所以关于α-熊果苷的制备方法主要通过生物转化法来实现。如今国外关于α-熊果苷合成的报道主要有Nishimura，Kitao，Kurosu，Prodanovic，Seo等；国内主要有张鹏、李群良、姜岷、庞宗文及杜刚等。但这些方法均存在以下一些问题： 

一、催化剂（菌体或酶）对对苯二酚的耐受度不高，无有效办法克服对苯二酚对催化剂的毒性，从而使反应体系中的对苯二酚浓度无法提高，导致α-熊果苷的产量普遍偏低，生产成本高居不下； 

二、催化剂使用寿命短，使用一次以后基本上就丧失了酶活力，无法实现多次循环使用，导致催化剂利用率不高； 

三、产物α-熊果苷后续分离纯化工艺复杂、设备投资及操作费用均较大； 

四、生产过程有含对苯二酚废水排放，导致环境污染。 

为了克服这些问题，利用游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷是很好的解决办法。通过把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，首先既可以大大提高反应体系中对苯二酚的浓度，又可避免反应体系中游离对苯二酚的存在，从而避免了游离对苯二酚对菌体生长代谢和酶活力抑制作用，进而极大地提高α-熊果苷的产量；其次，利用菌体游离细胞作为催化剂，具有多次重复使用的优点，提高了催化剂利用率，节约了菌体发酵原材料成本；再者，待反应结束后，固定在树脂上的产物和未反应的对苯二酚只需用简单过滤即可从反应体系中分离出来，简化了后续产物分离纯化工艺及设备投资，并减少了反应体系对苯二酚废水的排放，避免了对环境的污染。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用固定化对苯二酚消除对苯二酚对菌体细胞的毒害作用，提高反应体系中对苯二酚的浓度，从而提高α-熊果苷的产量，实现低成本大规模生产α-熊果苷的目的。其中固定化对苯二酚即采用大孔吸附树脂吸附法对对苯二酚进行固定化，并用此固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243游离细胞催化合成α-熊果苷的反应物，在最佳反应条件下催化合成α-熊果苷。该方法具有提高菌体对对苯二酚的耐受度，简化产物后续分离纯化工艺，提高菌体细胞使用寿命，减少含酚废水排放等优点，大大降低了α-熊果苷生产成本，为大规模低成本生产α-熊果苷奠定了基础。 

本发明的整体技术构思是： 

利用大孔吸附树脂对对苯二酚进行固定化，然后用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的游离细胞在缓冲溶液系统中催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷，该方法由下列工艺步骤组成： 

（1）固定化对苯二酚的制备； 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备，其中包括种子培养和发酵罐培养；