[发明专利]云南杜鹃高效再生体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于杜鹃花生物技术育种领域，具体涉及一种云南杜鹃高效再生体系的建立方法，可用于云南杜鹃基因工程和无性突变系筛选。

背景技术

云南杜鹃（Rhododendron yunnanense）为杜鹃花科，杜鹃属灌木或小乔木，主要分布于云南（西、西北、北、东北部）、陕西南部、四川西部、贵州西北、西藏东南部，境外缅甸东北部也有分布。生于山坡杂木林、灌丛、松林、松-栎林、云杉或冷杉林缘，海拨1600米—4000米。

本发明人于2008年开始从云南的中甸、大理、师宗、梁王山引种云南杜鹃至云南省农科院花卉所资源圃（昆明），发现云南杜鹃是杜鹃花基因工程育种理想的基因表达受体材料，因云南杜鹃植株移栽易于成活，次年即可开花，播种实生苗3年后也可开花，可见云南杜鹃抗逆性强，具有很强的适应性和比较广的适应范围。

植物遗传转化即转基因技术是近四十年来发展起来的一项生物技术。利用转基因技术可以在保持木本植物原有较好遗传背景的前提下定向改变某些性状，同时还能大大缩短育种时间，这为克服木本植物传统育种局限性，加速木本植物遗传育种进展提供了便利。目前转基因技术已成为木本植物遗传育种的主要研究领域。然而转基因技术极大的依赖于体外培养物能够高效稳定再生成完整植株的技术，建立高效稳定的遗传转化受体系统是转基因育种的基础。而木本植物组织培养和植株再生的难度较大。如缺乏合适的转化受体材料，难以建立高效稳定的遗传转化体系。其次是基因型依赖性较强，转化效率不高。因此，系统深入研究影响云南杜鹃植株再生因子、诱导植株再生的方法并获得再生植株，建立专门针对云南杜鹃的高效稳定的再生体系，具有重要意义，可为云南杜鹃转基因育种工作提供理论基础和实验依据，同时将有效推进杜鹃花生物技术育种进程。云南杜鹃的再生体系研究至今未见报道。

发明内容

本发明目的是提供一种专门针对云南杜鹃的高效再生体系的建立方法。

本发明所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，包括以下步骤：

（1）无菌苗的获得

取侧芽饱满的云南杜鹃半木质化茎段，剪成带有1～2个侧芽的

茎段，用洗衣粉水清洗，之后清水漂洗干净，在无菌条件下依次用质量分数为0.12%的升汞溶液浸泡15min，质量分数为2%的次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗3～5次，切去茎段两头接种于诱导培养基上诱导侧芽萌发，待不定芽长至2～3cm时切下不定芽转入增殖培养基上培养获得无菌苗，所述的诱导培养基为MS + 6-BA 1mg/L+ NAA 0.1 mg/L，pH值为5.4；所述的增殖培养基为：WPM + ZT 2 mg/L，pH值为5.4；

（2）再生体系的建立

①叶片直接再生不定芽

将步骤（1）中获得的28～32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成0.5cm²～0.8cm²的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于叶盘分化培养基A中或叶盘分化培养基B中，叶盘分化培养基A为：WPM+TDZ 0.4 mg/L+ NAA0.05 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4，叶盘分化培养基B为：WPM+ZT 2～4mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；

或②叶片间接再生不定芽

A. 将步骤（1）中获得的28～32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成约0.5cm²～0.8cm²的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于愈伤组织诱导培养基中培养，所述的愈伤组织诱导培养基为：WPM+TDZ 0～0.5 mg/L+2,4-D1.0 mg/L+水解酪蛋白0～500 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；

B. 将步骤（2）②A中得到的愈伤组织转接入愈伤组织分化培养基中诱导不定芽，所述的愈伤组织分化培养基为：WPM+ZT4.0mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；

（3）壮苗培养

将步骤（2）①叶片直接再生不定芽培养出的不定芽或将（2）②叶片间接再生不定芽培养出的不定芽分棵切开或切成3-5棵为一丛放入壮苗培养基中培养20～25天，所述的壮苗培养基为：WPM+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；

（4）生根培养