[发明专利]抗草甘膦转基因大豆种子中磷酸肽的分离富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸肽新型富集材料MWNTs-COOH的合成以及利用液相色谱-质谱联用技术检测转基因大豆中磷酸肽的方法。

背景技术

自抗草甘膦转基因大豆商品化以来，已经建立了不少的检测方法，以检测核酸为目标的各种PCR检测技术以及PCR快速检测试剂盒；以检测外源蛋白为目标的ELISA检测技术以及酶联免疫快速检测试纸条、试剂盒，这些检测方法都可以为鉴定转基因作物以及为转基因作物的环境安全评价提供技术支持。但是自中国2009年批准转基因水稻和转基因玉米生产安全证书的释放，成为第一个批准主粮商业化种植的国家后，对转基因作物安全性评价、特别是转基因作物在食品安全性评价方面提出更高的要求。

生物信息是按DNA→mRNA→蛋白质→代谢产物方向流动的，代谢物是细胞调控过程的终产物，它们的种类和数量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应(Fiehn，2002)，转基因作物均是通过调控基因的表达来控制目的性状的改变，基因表达上极微小的变化即可导致代谢物种类、含量、分布的大幅改变。因此，对转基因作物代谢物的分离鉴定，检测分析可以为生物安全、特别是食品安全相关预警信号提供一个预知平台，也可以为转基因产品在安全性评价方面提供一种新的技术。

由于植物代谢物在时间和空间都具有高度的动态性，且产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，难于进行分离鉴定，所以人们一直在寻找更为强大的检测分析方法，力求可检测到样品中的每种代谢物。代谢物的分析通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法，比较不同样品中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析，研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究，再结合模式识别方法，有可能找出与之相关的生物标志物。

用于代谢物检测的主要技术手段是核磁共振(NMR)，质谱(MS)，色谱(HPLC，GC)等。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征，由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物。此外，质谱分析发现，代谢产物的同质性不高，由于缺乏均匀性，使色谱分析变得更加困难，无法识别出样品中的未知物质。采用核磁共振(NMR)的方法，可以弥补色谱的不足，但由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。因此，对代谢产物的分析最大的挑战就是对代谢产物的识别以及高效的检测方法。

抗草甘膦转基因大豆中外源EPSPS基因的表达阻断植物体内芳香族氨基酸和某些由其参与合成的维生素、生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、吲哚衍生物、酚类物质等次生代谢物的生物合成。在这个过程中，一小部分蛋质发生磷酸化，并且被大量的非磷酸肽所遮蔽，很难检测，为了更加灵敏的检测转基因与非转基因在磷酸肽含量方面的差异，建立一种高灵敏度和高特异性检测磷酸肽的方法十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以高效富集抗草甘膦转基因大豆种子中磷酸肽的分离富集方法，可以更加灵敏的检测转基因与非转基因大豆在磷酸肽含量方面的差异。

本发明提供的一种新型高效富集材料和富集方法为：

1、以MWNTs-COOH为固相载体，通过水热法在MWNTs-COOH表面修饰上TiO₂纳米颗粒，合成了一种高效富集材料，利用标准磷酸化蛋白β-casein对其富集效率进行评价表明此方法对磷酸肽有较高的选择性，富集效率可以达到25mg/g。

2、磷酸化肽的分离，富集及检测被以下方法实现：

1)以50％的乙腈作为上样溶剂，将含有目标物磷酸肽的上样溶剂流过装有10mg新合成高效富集材料的固相萃取柱；

2)以浓度为0.1％的10ml三氟乙酸清洗上述吸附有目标物的固相萃取柱3次，收集洗脱液。

3)所收集的洗脱液使用液质进行磷酸肽含量测定。

本发明提供的方法可以解决在实际样品中由于磷酸肽含量丰度很低并且被大量的非磷酸肽所抑制而造成的检测困难问题，可以简便高效的实现对转基因大豆种子萌发过程中磷酸肽变化情况的检测。

具体实施方式

实施例1、高效富集材料的合成